Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCC8 liên quan tới bệnh đái tháo đường sơ sinh

Nội dung text: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCC8 liên quan tới bệnh đái tháo đường sơ sinh

1. T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 6-2021 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ABCC8 LIÊN QUAN TỚI BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG SƠ SINH 1 1 3 Triệu Tiến Sang , Trần Văn Khoa , Nguyễn Thị Trang 3 1 Nguyễn Thị Ánh Tuyết , Nguyễn Thanh Tùng 1 1 2 Trịnh Thế Sơn , Nông Quốc Tuấn , Trần Ngọc Thảo My TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCC8 liên quan tới bệnh đái tháo đường sơ sinh. Đối tượng và phương pháp: Một đột biến gen ABCC8 phát hiện ở một bệnh nhân (BN) mắc đái tháo đường sơ sinh tại Việt Nam được sử dụng để thiết kế đoạn mồi cho phản ứng khuếch đại chuỗi PCR. Phản ứng này khuếch đại đoạn gen mang đột biến trên tổng cộng 33 mẫu bệnh phẩm, sau đó kết hợp phương pháp giải trình tự Sanger để phát hiện đột biến liên quan đến bệnh đái tháo đường sơ sinh. Kết quả: Phát hiện 2 trường hợp (6,06%) mang đột biến c.3422A>G trên đoạn exon 28 của gen ABCC8. Còn 31 mẫu (93,94%) không phát hiện mang đột biến nào trên exon được khảo sát. Kết luận: Quy trình được xây dựng mang lại ý nghĩa quan trọng và giúp ích cho quá trình phát hiện đột biến gen ABCC8. * Từ khóa: Đái tháo đường sơ sinh; Đái tháo đường; Bệnh chuyển hóa; Gen ABCC8; Quy trình phát hiện chẩn đoán. Establishing a Procedure to Detect ABCC8 Gene Mutations Related to Neonatal Diabetes Mellitus Summary Objectives: To establish a procedure to detect ABCC8 gene mutations related to neonatal diabetes mellitus. Subjects and methods: An ABCC8 gene mutation related to neonatal diabetes mellitus found in a Vietnamese patient was used to design primers for PCR (Polymerase Chain Reaction) to amplify the segment spanning the mutation. Then, combined with Sanger sequencing, a procedure was developed to detect mutations on the ABCC8 gene on 33 DNA samples to screen for pathogenic alleles. Results: The established procedure detected 2 cases with ABCC8 mutations (6.06%) while no pathogenic allele was found in the remaining 31 cases. Conclusion: The developed procedure was helpful for the diagnosis process of diabetes mellitus, especially in families with a history of the disease. * Keywords: Neonatal diabetes mellitus; Diabetes mellitus; Metabolic disorders; ABCC8; Procedure. 1 Học viện Quân y 2Faculty of Science and Engineering, Sorbonne University 3 Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi: Triệu Tiến Sang (trieusangk83@yahoo.com.vn) Ngày nhận bài: 03/6/2021 Ngày bài báo được đăng: 11/6/2021 41
2. T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 6-2021 ĐẶT VẤN ĐỀ trong tế bào [2, 3]. GDM được xác định khi ph n có l ng ng huy t cao Thuật ngữ “Đái tháo đường” (Diabetes ụ ữ ượ đườ ế c phát hi n l n u tiên trong thai k . mellitus - DM) mô tả một nhóm các rối đượ ệ ầ đầ ỳ GDM c áp d ng k c khi không còn loạn chuyển hóa không đồng nhất, đặc đượ ụ ể ả trưng và phát hiện bởi nồng độ đường hiện tượng tăng cao glucose trong máu huyết tăng cao. Bệnh hình thành do sau khi sinh con hay hiện tượng này đã những khiếm khuyết trong quá trình tiết xuất hiện trước khi mang thai mà chưa insulin, hoạt động của insulin hoặc cả hai được chẩn đoán [3]. và do những thay đổi trong quá trình Khác biệt với các loại đái tháo đường chuyển hóa carbonhydrate, chất béo và đa gen này cũng tồn tại một số loại đái protein. Đái tháo đường để lại tác động tháo đường đơn gen gây ra bởi đột biến lâu dài lên người mắc, bao gồm các bệnh di truyền trên những gen quy định chức về võng mạc, thận, thần kinh cùng nhiều năng của tế bào β. Rất hiếm để bắt gặp biến chứng phức tạp khác, đặc biệt về tim những trường hợp mắc đái tháo đường mạch. Bệnh đái tháo đường xuất hiện ở đơn gen, tuy nhiên chúng có ảnh hưởng mọi quần thể trên thế giới, bất kể vị trí địa đặc biệt quan trọng và chiếm 1 - 2% số ca lý. Theo thống kê của WHO cho tới năm mắc đái tháo đường [4, 5]. Tuy nhiên, loại 2014, gần 422 triệu người trưởng thành đái tháo đường này thường không được được chẩn đoán mang bệnh và ước tính nhận biết chính xác. Hầu hết BN bị chẩn tăng lên 629 triệu người vào n ăm 2045. đoán sai thành đái tháo đường týp 1 hoặc nh h ng c a b nh ái tháo ng Ả ưở ủ ệ đ đườ để týp 2, dẫn tới việc đưa ra phác đồ điều trị l i vô cùng n ng n , không ch lên m i gia ạ ặ ề ỉ ỗ không hiệu quả và không thể phát hiện ình có ng i m c b nh mà còn nh đ ườ ắ ệ ả các thành viên khác trong gia đình có khả h ng tiêu c c t i n n kinh t và xã h i ưở ự ớ ề ế ộ năng mắc bệnh [5, 6]. Các kiểu hình của c ng nh n ng su t lao ng c a các ũ ư ă ấ độ ủ đái tháo đường đơn gen bao gồm: Đái nước có thu nhập thấp và trung bình [1]. tháo đường khởi phát ở tuổi trưởng thành Thông thường, bệnh đái tháo đường (MODY - tuổi khởi phát là trước 25 tuổi) được chia làm 3 loại chính: Đái tháo và đái tháo đường sơ sinh (NDM - đượ c đường týp 1 (T1DM), đái tháo đường týp chẩn đoán trước 6 tháng tuổi). Về mặt di 2 (T2DM) và đái tháo đường thai kỳ truyền học, những đột biến dị hợp tử gen (GDM). T1DM hình thành do hệ miễn dịch KCNJ11 có liên quan đến bệnh đái tháo phá hủy các tế bào β của tuyến tụy khiến đường sơ sinh được ghi nhận lần đầu cho quá trình sản xuất insulin bị ảnh tiên vào năm 2004 ở người và 2 năm sau hưởng, từ đó người bệnh phải phụ thuộc đó bắt đầu phát hiện những đột biến vào insulin ngoại sinh. Phổ biến hơn tương tự trên gen ABCC8. Cho đến nay, T1DM, T2DM gây ra bởi sự giảm tiết và những đột biến ở 2 gen này được chứng kháng insulin. Sự kháng này là hậu quả minh là nguyên nhân dẫn đến gần 40% của hiện tượng suy giảm các thụ thể ca mắc đái tháo đường sơ sinh, do đó, có insulin hay insulin không thể bám vào thụ nhiều nghiên cứu chuyên sâu về vấn đề thể hoặc rối loạn vận chuyển glucose vào này [5]. 42
3. T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 6-2021 Gen ABCC8 có vị trí 11p15.1 và độ dài CS (01/2020), tổng cộng 748 đa hình gây khoảng 84 kb (17.414.538 - 17.493.323), bệnh và có khả năng gây bệnh trên gen bao gồm 39 exon, thuộc họ protein ABC - ABCC8 được phát hiện ở BN mắc đái họ các protein vận chuyển chủ động liên tháo đường sơ sinh [8]. Nếu có thể xác kết với ATP. Gen mã hóa cho 1.582 định đột biến gen ABCC8 liên quan tới amino acid của protein SUR1 - thụ thể kênh KATP, BN sẽ được điều trị với thuốc nằm trên kênh KATP xuyên màng sinh uống sulfonylureas thay vì sử dụng insulin chất. Nhờ kênh KATP này, các t ế bào β đến cuối đời. Chính vì vậy, chúng tôi thực tuyến tụy có th ể điều hòa quá trình tổng hiện đề tài này nhằm: Nghiên cứu xây hợp và tiết insulin; tuy nhiên, các đột biến dựng quy trình ứng dụng các kỹ thuật trên gen ABCC8 khiến cho kênh KATP sinh học phân tử vào chẩn đoán đột biến không thể đóng lại dẫn đến hiện tượng gây bệnh đái tháo đường sơ sinh, từ đó giảm tiết insulin và tăng glucose trong đưa ra phương hướng điều trị phù hợp và máu, từ đó hình thành đái tháo đường [7]. hiệu quả, nâng cao chất lượng cuộc sống Theo báo cáo cập nhật của De Franco và cho người bệnh. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 1: Quy trình phát hiện đột biến gen ABCC8. 43
4. T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 6-2021 1. Đối tượng nghiên cứu khuếch đại toàn bộ exon 28 của gen Mẫu máu của một gia đình 3 thành ABCC8: F: 5’-GAACCTGTTCAGTCCTGTGG-3’; viên gồm bố (30 tuổi - chẩn đoán mắc đái R: 5’-CTTTCTTGATTACTGGGACCAG-3’. tháo đường vào tuổi 28), mẹ (29 tuổi - Nhiệt độ nóng chảy của mỗi mồi lần lượt o o bình thường, không mang triệu chứng là 58,12 C và 56,43 C và chúng khuếch của đái tháo đường) và con trai, trong đó đại đoạn gen dài 274 bp, bao gồm toàn người con được chẩn đoán mắc NDM vào bộ exon 28. tuần tuổi thứ 8 tham gia vào nghiên cứu. Sau đó, phản ứng PCR được thực hiện bằng cặp mồi này sử dụng các mẫu 2. Phương pháp nghiên cứu ADN thu thập được từ 33 mẫu máu toàn ADN t ng s c a ng i con c gi i ổ ố ủ ườ đượ ả phần nhằm khảo sát đột biến trên gen trình t th h m i (NGS) kh o sát t ự ế ệ ớ để ả độ ABCC8. Mỗi ống phản ứng có thể tích 25 bi n và xác nh là mang t bi n ế đị độ ế µl, trong đó chứa 12,5 µl GoTaq Green c.3422A>G (p.Glu1141Gly) - m t t bi n ộ độ ế Mastermix 2X (Lot.No. 0000440041; hạn d h p t trên exon 28 c a gen ABCC8 ị ợ ử ủ sử dụng: 5/2023), 7,5 µl nước, 0,5 µl mỗi ( t bi n nh m ngh a m c protein). độ ế ầ ĩ ở ứ độ mồi, 4,0 µl ADN. Dựa vào nhiệt độ nóng Đồng thời thu thập 30 mẫu máu tĩnh chảy của cặp mồi, phản ứng PCR được mạch của các BN được chẩn đoán đái thực hiện với dải gradient nhiệt độ gắn tháo đường và đang điều trị tại Bệnh viện mồi từ 52 - 62oC. Dựa vào kết quả phản Đại học Y Hà N ội. Các mẫu máu được ứng này, nghiên cứu lựa chọn 55oC là lưu trữ vào ống chứa chất chống đông nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất. Phản ứng EDTA và bảo quản, vận chuyển ở nhiệt này được lặp lại 3 lần và kết quả các lần o độ 4 C cho đến khi sử dụng. thực hiện là đồng nhất. Vì vậy, phản ứng * Tách chiết ADN toàn phần từ máu PCR sử dụng cặp mồi ABCC8F, ABCC8R tĩnh mạch: ADN được tách chiết từ mẫu được hiện theo quy trình như sau: 95oC 5 máu toàn phần theo quy trình của bộ kít phút, 35 chu kỳ gồm 94oC 30 giây, 55oC ADN sau tách chiết sẽ được kiểm tra chất 30 giây, 72oC 30 giây và 72oC 5 phút. lượng (nồng độ và độ tinh sạch) bằng Những đoạn gen sau khuếch đại sẽ được máy đo SpectraMax QuickDrop. Do vậy, điện di trên gel agarose 2% trên hệ máy ADN thu nhận từ 33 mẫu bệnh phẩm đạt multiSUB Choice (Cleaver Scientific, chất lượng mong muốn và s ẽ được sử SKU: MSCHOICE) để kiểm tra sản phẩm dụng trong các bước tiếp theo của nghiên mong muốn. cứu. ADN được lưu trữ và b ảo quản tại * Giải trình tự Sanger: Các băng sản o nhiệt độ -20 C. phẩm PCR sau khi được kiểm tra bằng * Thực hiện phản ứng khuếch đại PCR điện di sẽ được giải trình tự theo nguyên (Polymerase chain reaction): Đầu tiên, lý Sanger để tìm đột biến trên c.3422A>G cặp mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn trên exon 28 của gen ABCC8. Ngoài ra, gen mang đột biến c.3422A>G bằng cách các đột biến trên exon 28 khác cũng có sử dụng phần mềm Primer-BLAST. Kết quả thể được phát hiện nhờ sử dụng kỹ thuật thiết kế cặp mồi cho ra 2 trình tự mồi F và R giải trình tự. 44
5. T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 6-2021 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Phản ứng khuếch đại PCR đoạn gen mang đột biến Phản ứng PCR được thực hiện 3 lần, sử dụng các thành phần và chu trình nhiệt được miêu tả như trên. Kết quả thu được là đồng nhất giữa các lần phản ứng. Sau đó, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose và quan sát dưới đèn UV. Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với ADN của 30 BN đái tháo đường. (M: thang chuẩn 100 bp) Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với ADN của bố và mẹ BN mắc NDM. (M: thang chuẩn 100 bp; (+): ADN của BN NDM) 45
6. T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 6-2021 Phản ứng PCR đã khuếch đại thành công đoạn gen mong muốn ở 32 mẫu ADN của nhóm nghiên cứu so với đối chứng dương là mẫu ADN của người mắc NDM mang đột biến c.3422A>G. Ở giếng tra mẫu đối chứng âm không xuất hiện bất kỳ băng nào, thể hiện mồi và thành phần phản ứng không bị tạp nhiễm. Băng điện di thu được không có sản phẩm phụ, hình ảnh sáng và rõ ràng tại vị trí gần 300 bp, chứng tỏ đoạn gen được khuếch đại mang đúng kích thước 274 bp như lý thuyết ban đầu. Từ đây, những sản phẩm này sẽ được tinh sạch để giải trình tự theo nguyên lý Sanger để phát hiện đột biến trên exon 28 của gen ABCC8. 2. Kết quả giải trình tự Sanger Trong tổng số 33 mẫu được giải trình tự Sanger, chỉ phát hiện 2 trường hợp (6,06%) mang đột biến c.3422A>G trên đoạn exon 28 của gen ABCC8. Còn lại 31 mẫu (93,94%) đều cho kết quả không phát hiện mang đột biến nào trên exon được khảo sát. Hình 4: Kết quả giải trình tự Sanger. (A): Mẫu ADN của con - BN mắc NDM; (B): Mẫu ADN của người bố; (C): Mẫu ADN của người không mang alen đột biến (kiểu dại). 2 trường hợp mang đột biến c.3422A>G duy nhất được xác định có quan hệ với nhau về huyết thống (bố - con). C ả hai đều mang đột biến dị hợp tử gen ABCC8 gây bệnh đái tháo đường. Trong khi đó, phân tích trình tự exon 28 của người mẹ trong gia đình này không phát hiện đột biến nào nên có thể khẳng định người bố với kiểu gen dị hợp tử đã truyền cho con trai alen đột biến, từ đó hình thành bệnh đái tháo đường sơ sinh. 46
7. T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 6-2021 Hình 5: Phả hệ gia đình có bố, mẹ, con trai mắc đái tháo đường sơ sinh. (Mũi tên chỉ người đầu tiên trong gia đình được phát hiện mắc bệnh (proband); theo thứ tự chú thích là tuổi tại thời điểm nghiên cứu và thời điểm phát hiện bệnh). BÀN LUẬN của kênh KATP ở các tế bào β tuyến tụy có Một đột biến điểm trên gen ABCC8 thể gây ra cả 2 th ể của đái tháo đường được phát hiện nhờ ứng dụng quy trình sơ sinh (PNDM - đ ái tháo đường sơ sinh kết hợp giữa phương pháp PCR truyền vĩnh viễn và TNDM) [10]. Những đột biến trên SUR1 gi m s ng n ch n c a ATP thống và giải trình tự NGS, Sanger. Đây ả ự ă ặ ủ trên kênh K có th gây ra ít nh t 3 là một đột biến thay thế nucleotide A>G ở ATP ể ấ tr ng h p sau: t ng ho t ng m c a vị trí 3422 trên exon 28 của gen, dẫn đến ườ ợ ă ạ độ ở ủ kênh, tăng ảnh hưởng của tương tác giữa thay đổi acid amin tương ứng là Mg - nucleotide và giữa vùng gắn glutamine thành glycine, dẫn đến đột biến nucleotide (NBD) và protein hoặc giảm độ nhầm nghĩa ở mức độ protein. Cho đến nhạy của ATP do sự kết hợp giữa Kir6.2 thời điểm hiện tại, chưa có chính thức và SUR1 [11, 12]. Trong trường hợp này, nào được đưa ra về đột biến này, tuy đột biến gen ABCC8 xảy ra ở vùng liên nhiên theo báo cáo của HGVS (Human quan đến vùng xuyên màng với vùng Genome Variation Society) năm 2019, NBD, khiến cho kênh này không thể đóng ây là m t bi n d di truy n theo quy lu t đ ộ ế ị ề ậ lại và luôn ở trạng thái mở, từ đó năng trội gây bệnh TNDM (transient neonatal 2+ chặn hoạt động của kênh Ca và sự tiết diabetes mellitus - ái tháo ng s đ đườ ơ insulin [10]. Tuy nhiên, ảnh hưởng này sinh không kéo dài), được ghi nhận lần được báo cáo là tương đồng với ảnh đầu tiên ở Paris (Pháp) [8]. Việc xảy ra hưởng của đột biến lên tiểu đơn bị Kir6.2 đột biến trên trình tự amino acid trên loại do các đột biến xuất hiện ở vùng 6q24, vì protein vận chuyển có trình tự bảo thủ vậy việc phân biệt BN mang những đột cao qua các loài (khỉ, chuột, thỏ, voi, chó, biến này còn gặp nhiều khó khăn trong gà ) khiến chức năng của protein ảnh xét nghiệm lâm sàng. Chính vì vậy, việc hưởng nghiêm trọng [9]. giải trình tự gen là một phương pháp hữu Theo nghiên cứu của Babenko, Polak hiệu để phát hiện đột biến đó, tư vấn, và CS, các đột biến dị hợp tử xuất hiện ở cung cấp cho bản thân người mang bệnh gen ABCC8 mã hóa cho tiểu đơn vị SUR1 và gia đình phương hướng điều trị và 47
8. T¹p chÝ y d−îc häc qu©n sù sè 6-2021 phòng tránh bệnh đái tháo đường sơ sinh 4. Naylor RN, et al. Genetics and một cách hiệu quả. pathophysiology of neonatal diabetes mellitus. Journal of Diabetes Investigation 2011; Theo nghiên c u c a Jung Hyun Kong ứ ủ 2(3):158-169. (2011), phát hiện một đột biến de novo 5. Murphy RS Ellard, AT Hattersley. trên gen ABCC8 trên exon 28 [12]. Đột Clinical implications of a molecular genetic biến này rất hiếm gặp (p.Arg1183Trp) và classification of monogenic β-cell diabetes. không l i nh ng tri u ch ng th ng để ạ ữ ệ ứ ườ Nature Clinical Practice Endocrinology & gặp của TNDM nên càng khẳng định Metabolism 2008; 4(4):200-213. được vai trò c ủa phân tích trình tự gen 6. Edghill EL and AT Hattersley. Genetic trong ch n oán b nh. Vi c k t h p c ẩ đ ệ ệ ế ợ ả disorders of the pancreatic beta cell and hai phương pháp giải trình tự NGS và diabetes (permanent neonatal diabetes and Sanger giúp cho việc xác định chính xác maturity-onset diabetes of the young). đột biến ngay từ những bước đầu trở nên Beta Cell in Health and Disease Springer. dễ dàng và tiết kiệm về mặt thời gian, từ 2008:399-430. đó ứng dụng giải trình tự Sanger để phát 7. Patch A, et al. Mutations in the ABCC8 hiện đột biến gây bệnh ở những người gene encoding the SUR1 subunit of the KATP trong gia đình trở nên cách đơn giản và channel cause transient neonatal diabetes, tiết kiệm hơn. Quy trình phát hiện đột biến permanent neonatal diabetes or permanent này có thể được ứng dụng rộng rãi v ới diabetes diagnosed outside the neonatal các đột biến liên quan đến đái tháo period. Diabetes, Obesity and Metabolism đường đơn gen nói riêng và có các bệnh 2007; 9:28-39. di truyền đơn gen khác nói chung. Từ đó, 8. De Franco E, et al. Update of variants trong tương lai mở rộng quy trình này cho identified in the pancreatic β‐cell KATP các đối tượng khác mang bệnh. channel genes KCNJ11 and ABCC8 in individuals with congenital hyperinsulinism KẾT LUẬN and diabetes. Human Mutation 2020; Qua kết quả giải trình tự Sanger của 41(5):884-905. những BN m ắc đái tháo đường, có thể 9. Klee P, et al. A novel ABCC8 mutation kết luận quy trình nghiên cứu xây dựng illustrates the variability of the diabetes đã phát hiện được đột biến c.3422A>G phenotypes associated with a single mutation. trên exon 28 của gen ABCC8, đồng thời Diabetes & Metabolism 2012; 38(2):179-182. cũng có thể phát hiện được các đa hình 10. Babenko AP, et al., Activating hoặc biến dị gây bệnh hoặc có khả năng mutations in the ABCC8 gene in neonatal gây bệnh khác xuất hiện trên exon này. diabetes mellitus. New England Journal of Medicine 2006; 355(5): 456-466. TÀI LI U THAM KH O Ệ Ả 11. Proks P, et al. A heterozygous 1. Organization, WH. Classification of diabetes activating mutation in the sulphonylurea mellitus 2019. receptor SUR1 (ABCC8) causes neonatal 2. Association AD. Diagnosis and classification diabetes. Human molecular genetics 2006; of diabetes mellitus. Diabetes care 2009; 15(11):1793-1800. 32(Supplement 1):S62-S67. 12. Kong J,H; JB Kim. Transient neonatal 3. Haghverdizadeh P, et al. ABCC8 genetic diabetes mellitus caused by a de novo variants and risk of diabetes mellitus. Gene ABCC8 gene mutation. Korean Journal of 2014; 545(2): 198-204. Pediatrics 2011; 54(4):179. 48