Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA xác định các kiểu đột biến lặp hoặc mất đoạn tại vị trí 1P và 16Q trên u nguyên bào thận

Nội dung text: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA xác định các kiểu đột biến lặp hoặc mất đoạn tại vị trí 1P và 16Q trên u nguyên bào thận

1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA XÁC ĐỊNH CÁC KIỂU ĐỘT BIẾN LẶP HOẶC MẤT ĐOẠN TẠI VỊ TRÍ 1p VÀ 16q TRÊN U NGUYÊN BÀO THẬN Đỗ Thị Ngọc Thùy1, Nguyễn Huỳnh Minh Quân2, Nguyễn Văn Thắng3, Bùi Chí Bảo4, Ngô Quốc Đạt5, Trần Thanh Tùng1,Phan Đặng Anh Thư5 TÓM TẮT Giới thiệu: U nguyên bào thận (UNBT) là loại u thận ác tính phổ biến nhất hiện nay ở trẻ em, thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi. Chẩn đoán xác định chủ yếu dựa vào kết quả xét nghiệm Giải phẫu bệnh và ngày nay việc đáp ứng điều trị còn phụ thuộc vào những biến đổi ở cấp độ sinh học phân tử. Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA phát hiện các kiểu đột biến mất hoặc lặp đoạn exon tại vị trí 1p và 16q trên khối mô vùi nến khối u thận. Đối tượng và Phương pháp: Mô tả cắt ngang 44 trường hợp được chẩn đoán xác định u nguyên bào thận tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Nhi đồng 1 từ 01/2015 đến 04/2021. Sử dụng khối vùi nến thực hiện phản ứng MLPA phân tích các kiểu đột biến mất hoặc lặp đoạn exon tại vị trí 1p và 16q. Kết quả: Tuổi trung bình của bệnh nhân có u nguyên bào thận là 3,34±0,45. Tỷ lệ nam nữ 1,2. 100% bệnh nhân có khối u ở một bên thận tại thời điểm chẩn đoán. U nguyên bào thận dạng mô học thuận lợi chiếm tỷ lệ cao nhất (97,7%) và u nguyên bào thận dạng không thuận lợi chiếm 2,2%. Di căn hạch chiếm tỷ lệ thấp (5,2%). Bệnh nhân được điều trị phẫu thuật ở giai đoạn 1 của bệnh chiếm đa số (52,3%), tiếp theo là giai đoạn 2 (38,6%). 19% bệnh nhân có mất đoạn exon trên NST 1p hoặc 16q. Kết luận: Kỹ thuật MLPA trên mẫu vùi nến có thể dùng để đánh giá tình trạng mất đoạn hay lập đoạn ở cấp độ exon khối u nguyên bào thận tuy nhiên cần chuẩn hoá kỹ thuật và quy trình do DNA dễ bị biến tính và đứt gãy vì quá trình xử lý và cố định mẫu. Từ khoá: U nguyên bào thận, U Wilms, MLPA ABSTRACT APPLICATION OF THE MLPA ASSAY IN THE MOLECULAR DIAGNOSIS OF CHROMOSOMES 1P AND 16Q ALTERATIONS IN NEPHROBLASTOMA Do Thi Ngoc Thuy, Nguyen Huynh Minh Quan, Nguyen Van Thang, Bui Chi Bao, Ngo Quoc Dat, Tran Thanh Tung ,Phan Dang Anh Thu * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 6 - 2021: 207 - 215 Introduction: Nephroblastoma or Wilms Tumor is the most common malignant kidney tumor in children, common in children under 5 years old. Definitive diagnosis is mainly based on pathology, and recently, the treatment and prognosis also depends on molecular alterations. Objectives: Using FFPE Tissue-Derived DNA, we applied the MLPA technique to detect and analyze the 1 Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Nhi Đồng 1 2 Trung Tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược TPHCM 3 Khoa Điều dưỡng và Kỹ thuật Y học, Đại học Y Dược TPHCM 4 Đơn vị Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Đồng Thành Phố 5 Bộ môn Mô Phôi - Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS. Phan Đặng Anh Thư, ĐT: 0947877908 Email:phandanganhthu@gmail.com Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 207
2. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 loss or repeat exon at 1p and 16q of the tumor cell. Material and Methods: Cross-sectional description of forty-four cases at Children's Hospital 1 from 1/2015 to 4/2021. Results: The mean age of patients with nephroblastoma was 3.34±0.45. Male to female ratio is 1.2. 100% of patients had a tumor in one kidney at the time of diagnosis. Favorable histology nephroblastoma accounted for the highest rate (97.7%), and unfavorable nephroblastoma accounted for 2.2%. Lymph node metastasis accounts for a low rate (5.2%). Most patients received surgical treatment at stage 1 (52.3%), followed by stage 2 (38.6%). 19% of patients have exon deletions on chromosomes 1p or 16q. Conclusions: The MLPA technique Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) can be used to evaluate alterations at the exon level in nephroblastoma, but is required standardization because the DNA is susceptible to denaturation and breakage due to the specimen fixation and processing Keywords: Nephroblastoma, Wilms Tumor, MPLA ĐẶT VẤN ĐỀ Ligation-dependent Probe Amplification), dựa vào phản ứng nối sử dụng đến 40 mẫu dò đặc U nguyên bào thận (UNBT) hay u Wilms là hiệu cho những chuỗi DNA khác nhau, cho kết loại u thận ác tính phổ biến nhất hiện nay ở trẻ quả nhanh chóng với độ nhạy công suất cao, giá em(1-3) đặc biệt thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi(4, 5), thành thấp(18) và dễ thực hiện(13). Nghiên cứu của bệnh phản ánh mối quan hệ chặt chẽ giữa dị tật chúng tôi được thực hiện với mục tiêu phân tích và sự phát triển khối u(6). Đặc điểm lâm sàng, các kiểu đột biến mất hoặc lặp đoạn exon tại vị trí tuổi, giai đoạn và chẩn đoán mô bệnh học giải 1p và 16q trên bệnh nhân UNBT bằng kỹ thuật phẫu bệnh khá đa dạng có thể ảnh hưởng đến MLPA. cách thức điều trị; điều này đã được chứng minh trong nhiều công trình nghiên cứu(7-9). Hiện nay ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU các dấu ấn sinh học cấp độ phân tử như phân Đối tƣợng nghiên cứu tích mất và lặp đoạn 1p hoặc 16q đã được đưa vào hướng dẫn phân loại tiên lượng điều trị ung Bệnh nhân chẩn đoán u nguyên bào thận thư theo United Kingdom Children’s Cancer được phẫu thuật lấy u trước hoá trị tại bệnh viện Study Group (UKCCSG)(10), tổ chức ung thư nhi Nhi đồng 1 từ tháng 01 năm 2015 đến tháng 04 Children ‘s Oncology group (COG)(11) và năm 2021. International Society of Paediatric Oncology Tiêu chuẩn chọn mẫu (SIOP)(12). Tất cả các trường hợp được chẩn đoán là u Hiện nay có nhiều kỹ thuật xác định nguyên bào thận được điều trị phẫu thuật trước (13) những thay đổi của chuỗi nhiễm sắc thể như tại Bệnh viện Nhi đồng 1. CGH(14), FISH(15), BAC arays(16), Southern blots và Tiêu chuẩn loại trừ thử nghiệm LOH(17). Hầu hết những kỹ thuật này đều có thể phát hiện đột biến mất đoạn hay lặp Các trường hợp thiếu các thông tin hoặc đoặn ở những exon riêng lẻ(13) nhưng mỗi kỹ mẫu được lấy bằng phương pháp sinh thiết lõi. thuật lại tồn tại những hạn chế riêng như tốn quá Phƣơng pháp nghiên cứu nhiều thời gian, công suất thấp và không nhạy Thiết kế nghiên cứu với những tái sắp xếp nhỏ trong cùng 1 gen. Chính vì lẽ đó mà chúng tôi sử dụng kỹ thuật Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca 44 trường khuếch đại đa đoạn dò hay MLPA (Multiplex hợp. 208 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh
3. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 Nghiên cứu Y học Quy trình tiến hành nghiên cứu Bảng 1: Phân nhóm nguy cơ theo mô học – Phân loại COG (24) Bốn mươi bốn trường hợp được chẩn đoán là u Nhóm nguy cơ Loại mô học trước hóa trị nguyên bào thận tại bệnh viện Nhi đồng 1 từ Mô học thuận lợi (không có hình ảnh tháng 1/2015 đến tháng 4/2015 được đánh giá, Thuận lợi thoái sản) phân tích đặc điểm mô bệnh học trên lam nhuộm Không thuận lợi Thoái sản lan toả hoặc khu trú Hematoxylin và Eosin và phân nhóm theo NWTS và COG (Bảng 1, Biểu đồ 1). Phân loại AREN03B2 Mô học thuận lợi Thoái sản 2 bên AREN0533 AREN0532 Nguy cơ cao AREN03B2 Nguy cơ rất thấp Nguy cơ trung Nguy cơ AREN0321 Nguy cơ trung bình bình thấp Nguy cơ cao AREN0534 AREN0532 Giai đoạn I/II Giai đoạn III GĐ I+II GĐ I+II Không có Giai đoạn I Không có LOH 1p, Có LOH 1p, LOH có 1p, 16q (<2t, <550g) 16q 16q LOH 1p 16q Nguy cơ Nguy cơ Nguy cơ Nguy cơ rất thấp Nguy cơ thấp trung bình trung bình cao Biểu đồ 1. Hướng dẫn phân loại nguy cơ theo COG cho UNBT (19) Sử dụng khối vùi nến thực hiện phản ứng Bước 3: Thực hiện phản ứng MLPA để nhân MLPA xác định các kiểu thay đổi bản sao của bản các các exon của các gen cần nghiên cứu. Sử bệnh nhân. dụng bộ Kit SALSA MLPA probemix P380 B1 Quy trình MLPA trên mẫu mô vùi nến Wilms Tumour (MRC - Holland) chứa các đoạn dò lai đặc hiệu với các vùng trên gen, ngoài ra Bước 1: Thu thập các khối mô vùi nến theo còn các đoạn nội chuẩn (đoạn gen tham khảo) tiêu chuẩn chọn mẫu. giúp kiểm chuẩn phản ứng MLPA. Sử dụng quy Bước 2: Chiết tách DNA: Sử dụng bộ kit trình kỹ thuật nhân bản dò MLPA, để xác định QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit.Thực các kiểu thay đổi bản sao trên máy PCR hiện theo đúng quy trình kỹ thuật tách chiết eppendorf. Quy trình thực hiện phản ứng MLPA DNA của nhà sản xuất cung cấp từ mẫu mô vùi do MRC – Holland cung cấp(20). nến. Đo nồng độ DNA sau tách chiết, để đảm Bước 4: Điện di mao quản: Quy trình kỹ bảo DNA có nồng độ trên 25ng/ L, độ tinh sạch thuật: thực hiện đúng quy trình thực hiện điện ở khoảng 1,8-2,0 (20). di mao quản trên máy giải trình tự ABI3500 do Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 209
4. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 hãng cung cấp. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bước 5: Phân tích kết quả: Kết quả sau khi Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận u thực hiện điện di sẽ được phân tích tự động để thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi (77,3%), trong đó tìm đột biến mất đoạn gen nhờ vào phần mềm thường gặp nhất ở trẻ 1-2 tuổi (27,3%), có 3 GeneMarker version 1.97 (Softgenetics, State trường hợp trẻ dưới 1 tuổi. Độ tuổi trung bình là College, PA). Kết quả sẽ được hiển thị dưới dạng 3,34±0,45; Tuổi thấp nhất trong nghiên cứu này bảng và dạng biểu đồ sóng (Electropherogram). là 4 tháng tuổi, và cao nhất là 12 tuổi (145 tháng) Phân tích và xử lý số liệu (Bảng 2). Tỷ lệ bệnh nhân nam và nữ trong nghiên cứu này là 1,2. Sử dụng phần mềm SPSS 25 để phân tích số liệu. Sử dụng tần số và tỉ lệ % để mô tả các biến Bảng 2: Phân bố u nguyên bào thận theo tuổi Nhóm tuổi Số lượng Tỷ lệ (%) định tính (nhị giá, thứ tự, danh định). Sử dụng <1 3 6,8 trung bình và độ lệch chuẩn để mô tả các biến 1-<2 12 27,3 định lượng. 2-<3 8 18,2 Y đức 3-<4 6 13,6 4-<5 5 11,4 Nghiên cứu đã được thông qua Hội Đồng 5-<6 2 4,5 Khoa Học và Đạo Đức trong Nghiên cứu Y sinh 6-<12 7 15,9 >=12 1 2,3 học bệnh viện Nhi Đồng 1, kèm theo giấy chứng Tổng cộng 44 100 nhận số 549/GCN-BVNĐ1 tháng 12 năm 2020. Bảng 3: Đặc điểm u nguyên bào thận Đặc điểm Tỷ lệ (%) Tuổi Trung bình 3,34±0,45 Giới: Nam Tỉ lệ nam/nữ =1,2 Nữ Vị trí u: Trái 47,7 Phải Tỉ lệ trái/phải =1,2 52,3 Hai bên 0 Mô bệnh học: Thuận lợi 97,7 Không thuận lợi Thuận lợi/Không thuận lợi= 43/1 2,3 Nhóm nguy cơ: Thấp 31,8 Trung bình 54,6 Cao 13,6 Giai đoạn u I 52,3 II 38,6 III 9,1 IV 0 Di căn hạch 5,2 Có 94,8 Không Tổng cộng N= 44 100 U thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi (77,3%), cứu này là 4 tháng tuổi và cao nhất là 12 tuổi (145 trong đó thường gặp nhất ở trẻ 1-2 tuổi (27,3%), tháng). U thường gặp ở giai đoạn I, chiếm hơn có 3 trường hợp trẻ dưới 1 tuổi. Độ tuổi trung 50% (52,3%), tiếp đến là giai đoạn II, chiếm bình là 3,34±0,45; Tuổi thấp nhất trong nghiên 38,6%. Không có trường hợp bệnh ở giai đoạn 210 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh
5. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 Nghiên cứu Y học 4,5 trong nghiên cứu này. Về đặc điểm mô học, DNA thu được dao động trong khoảng 30- đa số được xếp nhóm thuận lợi (nguy cơ thấp và 450ng/ L. Lượng DNA đủ để thực hiện MLPA là trung bình) chiếm 97,7%. Chỉ có 1 trường hợp 25ng/mL. Tỷ số OD 260/280nm trong khoảng 1,8- không thuận lợi (nguy cơ cao) được ghi nhận 2,0.Trong 44 mẫu vùi nến chẩn đoán UNBT được trong thời gian nghiên cứu. Trong 38 mẫu có lưu trữ và thực hiện phản ứng MLPA, có 26 mẫu phẫu thuật hạch ổ bụng có 2 trường hợp di căn thu được kết quả, 18 mẫu không xác định được hạch lympho (5,2%), 6 trường hợp không phẫu kết quả. Những mẫu thu thập từ năm 2018 có tỷ thuật hạch nên không đánh giá (Bảng 3). lệ thực hiện MLPA thành công hơn so với những mẫu thu thập trước 2018 (tỷ lệ trên 66,7%). Có Kết quả phân tích các kiểu đột biến mất hoặc 05/26 bệnh nhân đã được chẩn đoán u nguyên lặp đoạn exon tại vị trí 1p và 16p bằng phƣơng bào thận có mất đoạn exon trên NST 1p hoặc 16q pháp MLPA (tỷ lệ 19%). Kết quả phân tích mẫu bằng phương pháp MPLA trên khối vùi nến cho thấy hàm lượng Tỷ lệ mất đoạn exon 150 100 50 0 19 15 11 8 NST 1p hoặc 16q NST 1p NST 16q NST 1p và 16q Có Không Biểu đồ 2: Kết quả xác định mất đoạn exon trên vị trí 1p và 16q Hình 1: Kết quả phân tích MLPA Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 211
6. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 Trong đó, 4/26 có mất đoạn exon ở NST số trẻ gái = 1,7 (21). Tuy nhiên trong nghiên cứu của 1p (15%), 3/26 mất đoạn ở 16q (11%) và 2/26 A.F. Uba và cộng sự, tỷ lệ nữ lại nhiều hơn LOH ở cả 1p và 16q (8%). Ngoài ra có 4/26 (15%) nữ/nam=1,9(2). trường hợp tăng đoạn trên 1p, đây cũng là một Về vị trí khối u, trong nghiên cứu của yếu tố chỉ dấu có tiên lượng điều trị (Biểu đồ 2, chúng tôi, u hiện diện một bên thận, trái hoặc Hình 1). Một số gen khác có liên quan cũng được phải, không có trường hợp hai bên tại thời phát hiện bằng kỹ thuật MLPA (Bảng 4). điểm xác định bệnh. Theo nghiên cứu của tác Bảng 4: Một số gen có liên quan khác được phát hiện giả Hoàng Ngọc Thạch, UNBT hai bên chiếm bằng kỹ thuật MLPA tỷ lệ 7%, cũng theo tác giả, nếu u xuất hện hai Gen biến đổi Số lượng Tỷ lệ Loại đột biến bên thận trong cùng thời điểm chẩn đoán, tiên WT1 2/26 8% Mất đoạn dị hợp tử lượng xấu hơn so với khác thời điểm(23). TP53 5/26 19% Tăng đoạn Xét về đặc điểm giai đoạn bệnh lúc chẩn 0/36 0% Mất đoạn IGF2 5/26 19% Tăng đoạn đoán, đa số được chẩn đoán ở giai đoạn I, chiếm MYCN 2/26 8% Tăng đoạn tỷ lệ cao nhất trong nghiên cứu 52,3%, giai đoạn II là 38,6%, giai đoạn III là 9,1%, Không có trường BÀN LUẬN hợp ở giai đoạn IV và V. Kết quả này phù hợp Đặc điểm bệnh nhân UNBT với nghiên cứu của Hoàng Ngọc Thạch và cộng sự, tỷ lệ giai đoạn bệnh 1,2,3,4,5 tương ứng là U nguyên bào thận là loại u thận ác tính phổ 41,3%, 26,09%, 26,09%,0%, 6,52%(23), còn trong biến nhất hiện nay ở trẻ em, độ tuổi dưới 5 là nghiên cứu của A.F.Uba 3,1%, 25%, 34,4%,37,5%, phổ biến. Trong nghiên cứu của chúng tôi, bệnh 0%(2). Theo Niedzielski và cộng sự, tỷ lệ sống còn nhân lớn nhất 12 tuổi (1 trường hợp), trẻ từ 1-2 không bệnh(EFS) ở các giai đoạn là 82.1%, tuổi có tần suất mắc bệnh nhiều nhất (chiếm 89,5%,75%, 44,4% và tỷ lệ sống toàn thể (OS) là 27,3%), nghiên của tác giả Trần Đức Hậu cũng 92,9%, 89,5%,87,5%,100%. như vậy đặc điểm giai cho thấy độ tuổi trung bình khi được chẩn đoán đoạn bệnh lúc chẩn đoán có ảnh hưởng đáng kể là 3,05 tuổi (36,7 tháng) (21). Số liệu này phù hợp đến EFS và OS của người bệnh. khi so sánh giai đoạn tuổi mắc UNBT nhiều nhất trong nghiên cứu của Hoàng Ngọc Thạch, Bệnh Về mô bệnh học trong nghiên cứu này, viện Nhi Trung Ương năm 2013. Tuổi trung bình chúng tôi chỉ ghi nhận 1 trường hợp không là 3,34 tuổi, thấp hơn trong nghiên cứu của C thuận lợi (nguy cơ cao) (2,3%) và 2/44 bệnh nhân Mitchell, tuổi trung bình là 2,71 và cao hơn có di căn hạch (4,5%). Theo nghiên cứu của trong nghiên cứu của A.F.Uba, với tuổi trung Niedzielski và cộng sự của tỷ lệ di căn hạch là bình là 4 tuổi(2, 10). 7%. Như vậy tỷ lệ di căn trong nghiên cứu này thấp hơn so với nghiên cứu khác. Tỷ lệ bệnh nhân nam/nữ là 24/20, như vậy không có sự khác biệt trong tần suất mắc bệnh ở Kết quả phân tích mẫu bàng phƣơng pháp nam và nữ. Trong một số nghiên cứu, tỷ lên nữ MPLA trên khối vùi nến mắc bệnh cao hơn so với nam.Nghiên của tác giả Đặc điểm DNA tách chiết từ mẫu mô vùi nến Trần Đức Hậu cũng cho thấy độ tuổi trung bình khi được chẩn đoán là 3,05 tuổi (36,7 tháng) (21). Mục đích của nghiên cứu này là ứng dụng Trong những nghiên cứu khác ở các nước phát kỹ thuật MLPA xác định đột biến gen, vì kỹ triển, không ghi nhận sự khác biệt về phân bố thuật MLPA có thể định lượng số lượng bản sao theo giới tính trên bệnh nhân UNBT (22), nhưng của nhiều trình tự trong một trong một phản trong nghiên cứu của Trần Đức Hậu tỉ lệ trẻ trai/ ứng. Sử dụng khối vúi nến có ưu điểm là nguồn 212 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh
7. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 Nghiên cứu Y học mẫu nghiên cứu dồi dào, tuy nhiên, vấn đề lớn 3/26 LOH ở 16q (11%). 2/26 LOH ở cả 1p và 16q nhất trong việc sử dụng khối vùi nến là chất (8%). Kết quả nghiên cứu này cũng khá tương lượng DNA chiết tách được vì DNA có thể bị đồng trong nghiên cứu của Hannah M. Phelps, đứt gãy, hư trong quá trình bảo quản hoặc kỹ trong đó có 17 % LOH ở 16q và 12% LOH ở 1p(27). thuật chất cố định ban đầu cũng ảnh hưởng đến Trong những nghiên cứu trước, LOH ở 1p và chất lượng DNA trong khối vùi nến sau này(24 -25). 16q cũng xác định được mối liên quan với tiên Quan trọng nhất trong quy trình chiết tách lượng sống của người bệnh. Như vậy trong 5 DNA là phảỉ đạt độ tinh sạch, hạn chế tối đa tạp trường hợp đã được chẩn đoán và xếp giai đoạn, chất vì tạp chất còn tồn dư sau chiết tách sẽ ảnh có thể dựa vào kết quả MLPA xác định có LOH hưởng đến quá trình gắn mồi và khuếch đại sản ở 1p và 16q làm tiêu chuẩn phân nhóm nguy cơ phẩm gen. Để kiểm soát quá trình này, chúng tôi trong điều trị theo COG. Căn cứ vào Biểu đồ 1, đo mẫu DNA trên máy Nanodrop, độ tinh sạch có một trường hợp trẻ <1 tuổi, giai đoạn I, xếp lại được tính theo tỷ lệ A260/280 trong khoảng 1,8- nhóm nguy cơ thấp, 03 trường hợp ở giai đoạn I 2,0. Các mẫu trong nghiên cứu đều đạt độ tinh hoặc II được xếp vào nhóm nguy cơ trung bình sạch cao, nếu mẫu nào chưa đạt, chúng tôi tiến và 01 trường hợp ở giai đoạn III của bệnh được hành chiết tách lại. Trong nhiều nghiên cứu so xếp lại vào nhóm nguy cơ cao. Theo Grundy P.E sánh trước đây, nhiều tác giả cũng nhận định sử và công sự, EFS sau 4 năm ở nhóm nguy cơ thấp dụng bộ chiết tách kit QIAamp DNA FFPE là 91,2%, còn ở nhóm nguy cơ trung bình là Tissue Kit sẽ thu được kết quả DNA tối ưu cho 83,9%, nhóm nguy cơ cao là 83,9%(19, 28). kỹ thuật MLPA(16,25), do đó chúng tôi lựa chọn bộ Tăng số lượng bản sao trên 1q kit này trong nghiên cứu của chúng tôi. Mặc dù chiết tách được mẫu DNA, độ tinh sạch của mẫu 4/26 có tăng số lượng bản sao trên 1p (15%). thử, nồng độ đạt chuẩn theo theo quy định Theo nghiên cứu của Hannah M. Phelps và cộng nhưng kết quả thực hiện MLPA vẫn không xác sự, những thay đổi bất thường về gen chiếm (27) định được. Chính vì thế mà trong 44 mẫu UNBT khoảng 30% trường hợp u nguyên bào thận , trong nghiên cứu, MLPA đọc được kết quả 26 NWTS và SIOP cũng đã nghiên cứu tỷ lệ sống mẫu, 18 mẫu không xác định được kết quả. sót, EFS ở các giai đoạn bệnh sau khi điều trị ở bệnh nhân có tăng đoạn trên 1q. Kết quả nhận Những mẫu thu thập từ năm 2018 trở về sau thấy những bệnh nhân có tăng 1p, EFS và OS sau có tỷ lệ thực hiện MLPA thành công hơn so với 8 năm thấp hơn so với nhóm không có tăng 1q, những mẫu thu thập trước 2018 (tỷ lệ trên EFS 77% và OS 88%, trong khi EFS ở nhóm còn 66,7%). Trong nghiên cứu của Alice Guyard và lại là 90% và 96%(27). Như vậy việc xác định tăng cộng sự, đã tiến hành so sánh chất lượng DNA số lượng số bản sao trên 1q có ý nghĩa lớn trong lúc lấy mẫu và sau 5,5 năm, kết quả là lượng việc đánh giá tiên lượng bệnh. DNA giảm 53% tính hiệu khuếch đại khi thực hiện qPCR cũng giảm từ 56-15%(26). Như vậy, Bất thường ở gen TP5 thời gian lưu mẫu càng gần vời thời điểm nghiên Trong nghiên cứu của chúng tôi, không thấy cứu, chất lượng và lượng mẫu DNA được đảm biến đổi mất đoạn ở gen TP53. Theo những bảo hơn. nghiên cứu trước đây, mất đoạn gen TP53, hiện Trong 26 trường hợp thực hiện phản ứng diện ở 50-60% UNBT dạng thoái sản lan tỏa(29). MLPA, phát hiện 05/26 bệnh nhân đã được chẩn Việc phát hiện những biến đổi ở gen TP53 bằng đoán UNBT có LOH trên NST 1p hoặc 16q phương kỹ thuật MLPA cũng có ý nghĩa trong u (19%). Trong đó, 4/26 có LOH ở NST số 1p (15%), nguyên bào thận dạng thoái sản lan tỏa. Trong Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 213
8. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 nghiên cứu của chúng tôi có một trường hợp học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã tài trợ kinh phí UNBT dạng thoái sản lan tỏa, nhưng không phát để thực hiện đề tài, cảm ơn tập thể khoa Giải Phẫu Bệnh hiện bất thường gen TP53 trên mẫu này. bệnh viện Nhi Đồng 1 đã tạo điều kiện cho chúng tôi tiến hành đề tài. Bất thường ở gen WT TÀI LIỆU THAM KHẢO Gen kiềm chế u, gồm WT1 và WT2. 2/26 1. Szychot E, Apps J, Pritchard-Jones K (2014). Wilms’ tumor: trường hợp có bất thường ở gen WT. Việc mất biology, diagnosis and treatment. Translational pediatrics. 2014;3(1):12. đoạn gen WT1 liên quan đến nhiều hội chứng 2. Uba A, Chirdan L (2007). Childhood Wilm's tumour: như WARG, Denys Drash, Beckwith- prognostic factors in north central Nigeria. West African journal of medicine. 2007;26(3):222-5. Wiedemann,< WT1 là tác nhân của 2 hội 3. Stiller C, Parkin D (1990). International variations in the chứng WARG và Denys-Drash, những bệnh incidence of childhood renal tumours. British journal of cancer. 1990;62(6):1026-30. nhân của 2 hội chứng này có nguy cơ bị u 4. Matsunaga E (1981). Genetics of Wilms' tumor. Human nguyên bào thận cao: với WAGR là trên 30% genetics. 1981;57(3):231-46. 5. Rivera MN, Haber DA (2005). Wilms' tumour: connecting (30) còn với Denys-Drash là 95% . Dome JS và tumorigenesis and organ development in the kidney. Nature cộng sự trong nghiên cứu về gen của các bệnh Reviews Cancer. 2005;5(9):699-712. 6. Pritchard-Jones K, Kelsey A, Vujanic G, Imeson J, Hutton C, nhân hội chứng Beckwith-Wiedemann năm Mitchell C (2003). Older age is an adverse prognostic factor in 2002, phát hiện gen WT2. WT2 nằm ở vị trí stage I, favorable histology Wilms’ tumor treated with vincristine monochemotherapy: a study by the United (31) 11p15 . Trên những bệnh nhân hội chứng Kingdom Children’s Cancer Study Group, Wilm’s Tumor Beckwith-Wiedemann có u nguyên bào thận, Working Group. Journal of clinical oncology. 2003;21(17):3269- 75. khoảng 5-10% bệnh nhân được phát hiện mất 7. Davidoff AM (2009). Wilms tumor. Current opinion in dị hợp tử (heterozygosity) của đoạn gen pediatrics. 2009;21(3):357. WT2(31). Việc nghiên cứu đột biến ở gen WT1 8. Green DM, Beckwith JB, Weeks DA, Moksness J, Breslow NE, D'Angio GJ (1994). The relationship between microsubstaging liên quan nhiều đến cơ chế di truyền và tiến variables, age at diagnosis, and tumor weight of children with triển của UNBT. stage I/favorable histology Wilms' tumor. A report from the National Wilms' Tumor Study. Cancer. 1994;74(6):1817-20. KẾT LUẬN 9. Breslow N, Sharples K, Beckwith JB, Takashima J, Kelalis PP, Green DM, et al (1991). Prognostic factors in nonmetastatic, Nghiên cứu chúng tôi ghi nhận u nguyên favorable histology Wilms' tumor. Results of the Third National Wilms' Tumor Study. Cancer. 1991;68(11):2345-53. bào thận thường gặp ở bệnh nhân nhỏ hơn 5 10. Mitchell C, Jones PM, Kelsey A, Vujanic G, Marsden B, tuổi, nhóm tuổi 1-2 tuổi chiếm tỉ lệ cao nhất. U Shannon R, et al (2000). The treatment of Wilms' tumour: results of the United Kingdom Children's cancer study group chủ yếu ở giai đoạn 1 (52,3%). Dạng mô học (UKCCSG) second Wilms' tumour study. British journal of cancer. 2000;83(5):602-8. thuận lợi chiếm ưu thế (97,7%). Thực hiện kỹ 11. Dome JS, Perlman EJ, Graf N (2014). Risk stratification for thuật MLPA phát hiện 05 trường hợp có mất wilms tumor: current approach and future directions. American Society of Clinical Oncology Educational Book. đoạn exon trên NST 1p hoặc 16q (tỷ lệ 19%). Kỹ 2014;34(1):215-23. thuật MLPA thực hiện trên mẫu vùi nến có 12. Vujanić GM, Sandstedt B, Harms D, Kelsey A, Leuschner I, de Kraker J, et al (2002). Revised International Society of nhiều khó khăn hơn thực hiện trên mẫu máu Paediatric Oncology (SIOP) working classification of renal hay mẫu mô tươi do mẫu DNA bị đứt gãy nhiều tumors of childhood. Medical and pediatric oncology. 2002;38(2):79-82. do quá trình bảo quản và cố định, có thể tạo nên 13. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002). Relative quantification of 40 nucleic những đột biến giả, cần chuẩn hoá kỹ thuật và acid sequences by multiplex ligation-dependent probe quy trình. amplification. Nucleic Acids Research. 2002;30(12):e57-e. 14. Kallioniemi A, Kallioniemi O-P, Sudar D, Rutovitz D, Gray Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn Đại JW, Waldman F, et al (1992). Comparative genomic 214 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh
9. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021 Nghiên cứu Y học hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid DNA extraction methods for MLPA analysis on FFPE tissue- tumors. Science. 1992;258(5083):818-21. derived DNA. American journal of clinical pathology. 15. Klinger K, Landes G, Shook D, Harvey R, Lopez L, Locke P, et 2017;147(1):60-8. al (1992). Rapid detection of chromosome aneuploidies in 25. Hedegaard J, Thorsen K, Lund MK, Hein A-MK, Hamilton- uncultured amniocytes by using fluorescence in situ Dutoit SJ, Vang S, et al (2014). Next-generation sequencing of hybridization (FISH). American journal of human genetics. RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and 1992;51(1):55. formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer 16. Snijders AM, Nowak N, Segraves R, Blackwood S, Brown N, and normal tissue. PloS one. 2014;9(5):e98187. Conroy J, et al (2001). Assembly of microarrays for genome- 26. Guyard A, Boyez A, Pujals A, Robe C, Van Nhieu JT, Allory Y, wide measurement of DNA copy number. Nature genetics. et al (2017). DNA degrades during storage in formalin-fixed 2001;29(3):263-4. and paraffin-embedded tissue blocks. Virchows Archiv. 17. Devilee P, Cleton-Jansen A-M, Cornelisse CJ (2001). Ever since 2017;471(4):491-500. Knudson. Trends in genetics. 2001;17(10):569-73. 27. Phelps HM, Kaviany S, Borinstein SC, Lovvorn HN (2018). 18. Stuppia L, Antonucci I, Palka G, Gatta V (2012). Use of the Biological drivers of Wilms tumor prognosis and treatment. MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number Children. 2018;5(11):145. alterations in human genetic diseases. International journal of 28. Wittmann S, Zirn B, Alkassar M, Ambros P, Graf N, Gessler M molecular sciences. 2012;13(3):3245-76. (2007). Loss of 11q and 16q in Wilms tumors is associated with 19. Dix DB, Fernandez CV, Chi Y-Y, Mullen EA, Geller JI, Gratias anaplasia, tumor recurrence, and poor prognosis. Genes, EJ, et al (2019). Augmentation of therapy for combined loss of Chromosomes and Cancer. 2007;46(2):163-70. heterozygosity 1p and 16q in favorable histology Wilms 29. Ooms AH, Gadd S, Gerhard DS, Smith MA, Auvil JMG, tumor: A Children’s Oncology Group AREN0532 and Meerzaman D, et al (2016). Significance of TP53 mutation in AREN0533 study report. Journal of Clinical Oncology. Wilms tumors with diffuse anaplasia: A report from the 2019;37(30):2769. children's oncology group. Clinical Cancer Research. 20. Qiaagen (2020). QIAamp DNA FFPE Advanced Handbook 2016;22(22):5582-91. Qiaagen: Qiaagen; 2020 [updated 05/2020; cited 2021 05]. 30. Kalapurakal JA DJ, Perlman EJ et al (2004). Management of Wilms' tumour: current practice and future goals. Lancet translational-research/dna-rna-purification/dna- Oncology. 2004;Jan;5(1):37-46. purification/genomic-dna/qiaamp-dna-ffpe-tissue-kit/. 31. Dome JS CM (2002). Recent advances in Wilms tumor 21. Trần Đức Hậu (2005). Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng và genetics. Current Opinion in Pediatrics. 2002;Feb; 14(1) 5-11. kết quả bước đầu điều trị u nguyên bào thận tại Bệnh viện Nhi trung ương từ 1998-2005. Đại học Y Hà Nội. 22. Kaatsch P (2010). Epidemiology of childhood cancer. Cancer Ngày nhận bài báo: 19/11/2021 treatment reviews 2010;Jun;36(4):277-85. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 22/11/2021 23. Hoàng Ngọc Thạch, Phó Hồng Diệp (2013). Phân loại u thận trẻ em và u nguyên bào thận theo SIOP 2001 tại Bệnh viện Nhi Ngày bài báo được đăng: 08/12/2021 Trung Ương từ 2019-2012. 2013;6(1):60. 24. Atanesyan L, Steenkamer MJ, Horstman A, Moelans CB, Schouten JP, Savola SP (2017). Optimal fixation conditions and Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 215