Nghiên cứu thành phần hóa học và xâỵ dựng quy trình định lượng thành phần chính của lá quan âm biển

Nội dung text: Nghiên cứu thành phần hóa học và xâỵ dựng quy trình định lượng thành phần chính của lá quan âm biển

1. NGHIÊN CỨU THÀNH PHÀN HÓA HỌC VÀ XÂỴ DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẢN CHÍNH CỦA LÁ QỦAN ÂM BIẼN (FOLIUM VITICIS ROTUNDIFOLIAE) ThS. Nguyễn Thị Xuân Dỉệu*, Hướng dẫn: PGS. TS. Trần Hùng* *BỘ môn Dược liệu , Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ĐẶT VẮN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU lá Quan âm biển bằng phương pháp UPLC-PDA Quan âm biển (Vitex rotundifolia L. f., Lamiaceae) Quy trinh định iượng được xây dựng và đánh giá mọc khá phổ biến ờ vùng ven biển nước ta, có quan írên máy UPLC Waters Acquity H-ClassT đầu dò PDA hệ gần gũi trong hệ thống phân loại thực vật với ỉoài V. với cột Acquity UPLC® BEH C18 (130Ấ; 1,7 ụm; 2,1 agnus-castus [1 ] đã được thử nghiệm lâm sàng, mm X 50 mm). chứng minh tác dụng và đang được sử dụng rộng rãi KẾT Q U Ấ yÀ BÀN LUẬN ờ châu Âu. Các nghiên cứu cho thấy hai loài này có Kết quả về thực vật học nhiều điểm tương đồng về thảnh phần hóa học và Kết quả mô tả hỉnh thái Quan âm biển đã xác nhận công đụng [ 2, 3, 4, 5, 6] hứa hẹn nhiều triển vọng đây là loài Viỉex rotundifolia L. f., Lamỉaceae. Đồng trong việc khai thác Quan âm biển như một nguồn thay thời các đặc điểm vi học của rễ, thân, lá, quả loài này íhể Toài V. agnus-castus vốn không có ở Việt Nam. cũng đã được mô tả (phụ íục 1). Hơn nữa, bân thân Quan âm biền cũng là nguồn dược Kết quả về hóa học liệu có nhiều tác dụng đáng lưu ý, đã được chứng Cao A (35 g) và cao B (35 g) được tiến hành sắc ký minh như tác dụng kiểu estrogen, chổng oxy hóa, cột chân khôna với pha động ia hỗn hợp n-hexan-ethyi kháng viêm, chống ung thư... va đa được sử dụng ở acetaí íăng dan độ phân cực sau đó dùng hỗn hợp nhiều nước trên thế giới. Ngoài ra, đây còn íà cây éthyl acetat-methanoi với tì iệ methanol tăng dần đen thuốc nằm trong danh mục cac cây thuốc và vị thuốc 100% methanol. Kểt quả: từ cao A đã tách thành 15 thiết yểu của Bộ Y tế nước ta. Tuy nhiên, ở Việt Nam, phân ổoạn (A rA ^), íừ cao B thu được 17 phân đoạn việc nghiên cứu về cây này còn sơ sài, việc sử dụng (Br B17). Việc kết tỉnh lại kết tủa từ phân đoạn Ae, À9 chủ yêu chỉ theo kinh nghiệm dân gian và chỉ mơi thu được Vi (2012,34 mg); A 4 thu được v 2 (413,40 dừng lại ở bộ phận dùng ià quả (Mạn kinh tử) mặc dù mg); A <5 thu được v 3 (206,21 mg); A 12 và A13 thu được những nghiên cứu gần đây cho thấy các bộ phận khác v 10 (245 mg); B13thu được v 5 (30 mg) và B14thu được của Quart âm biển cũng có nhiều tác dụng đầy hứa v6 (46,29 mg). hẹn. Vi vậy, nhằm khoa học hóa, mở rang phạm vi Phần nước cái còn lại cùa phân đoạn 4A (2 g) sau khai thác sư dụng Quan âm biển, đề tài đặt vấn đề khi cô loại dung môi được tiến hành tách các phân nghiên cứu về mặt thực vật học cay Quan âm biển và đoạn bằng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển, rủ’a giải với tậpy trung nghiên cứu thành phần hóa học và phương dung mồi nền n-hexan tăng dần tỉ lệ ethyl aceỉat từ 0 % phằp định Tượng ỉhành phần hoạt chất chính của la đến 100%. Kết quả thu đừực 15 phân đoạn khác nhau Quan âm biển nhằm tăng cưởng khả năng khai íhác (A4a-A4o). Việc kết tinh lại kết tủa từ phân đoạn A4c thu thường xuyên mà không hủy hoại cây. được Vg (308,66 mg), từ phân đoạn A4Ơ thu được v2 ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu (402,02 mò). Đổi tượng Phần con lại của Ae (1,18 g) cũng được tiến hành sắc ký cột cổ điền, pha đọng n-hexarì-eíhyl aceíat tăng Cây Quan âm biền Vitex rotundifolia L. f., dần tí iệ ethyi acetat từ 0% đến 100%. Kết quả thu Lamiaceae) được thu hái ở TP. Nha Trang, tỉnh Khánh được 12 phân đoạn khác nhau (Aea-Aei). Kết tủa trắng Hòa vào tháng 8/2013. từ phân đoạn Aộd và Aee sau khi ly tâm, rửa bằng Phương pháp nghiên cứu methanol nhiều lần íhu được 22,41 mg v 3. Khào sát thực vật học Chất tinh thể hình khối,, màu vàng. ESI-MS: m/z Đặc điềm hình thái và giải phẫu rễ, thân, lá, quả 373,59 [M-HĨ, 397,59 [M +Naf (C 19híis08). 1H NMR cùa mẫu cây được thực hiện bằng các phương phốp (DMSO-de, 500 MHz): 6,87 (1H, s; hỉ- 8); 7,59 (1H; d; 2 thường quy. Hz; H-2'); 7,11 (1H; d; 9 Hz; H-5'j; 7,59 (1H; dd; 9 Hz, Khảo sát hóa học 2 Hz; H~6 ); 3,80 (3H; s; 3-OCHa); 3, 73 (3H; s; 6 - Cao toàn phần íá Quan âm biển được chiết bằng OCH3); 3,92 (3H; s; 7-OCH3); 3,87 (3H; s; 4’-OCH& phương pháp ngấm kiệt với ethanol 70%, Cao này sau 12,60 (1H; s; 5-OH); 9,41 (1H; s; 3’-OH). 13c NMR khi loại ethanol, bằng kỹ thuật chiết phân bố lỏng-iỏng (DMSỎ-de, 125 MHz): 155,6 (s; C-2); 138,0 (s; C-3); đã phân tách thành hái phân đoạn: cao chloroform 178,3 (s; C-4); 151,7 ( s; C-5); 131,6 (s; C-6); 158,7 ( s; (cao A) và cao ethyi aceíat (cao B). Các chất tinh khiết C-7); 91,3 (6; C-ể); 151,8 (s; C-9); 105,6 (s; C-10); được phân lập từ các phân đoạn cao này bằng sắc ký 122,2 (s; C-1); 115,1 (ó; C-2'); 146,4 (s; C-3’); 150,3 cột và kỹ thuạt kếí tinh lại. cấu trúc các chất được xác (s; 0 4 ’); 111,9 (ú; C-5'); 120,4 fd; C-6 ’); 59,7 (q; 3- định dựa vào dữ liệu phổ MS, NMR và đối chiếu với tài OCH3); 60,0 (q; 6 ~OCH3); 56,5 (q; 7-OChÌ3); 55,7 ( i 4'- liệu tham khảo[7, 8, 9,10,11 ]. OCH3). Xây dựng quy trình đĩnh lượng đồng thời ba Chất v 2: tinh thể màu trắng. ESÍ-MS: m/z 401,74 flavonoid casticin, cynarosid và isooríentin trong [M+Na]+ (C22H34O5). 1H NMR (CDCI3, 500 MHz): 1,33 -662-
2. (1H; m; H-1);1,40 (1H; m; H-1); 1,50 (1H; m\ H-2); 1,63 C-29); 21,2 (ợ; C-30). (1H; nr H-2); 1 33 (1H; m\ H-3); 1,16 (1H; m; H-3); Chất v s: bột màu vàng. ESI-MS: m/z 447,62 [M-H]', 1 47 (1H; d; 2 Hz; H-5); 5,38 (1H; d; 2 Hz; H-6); 2,20 471.75 [M +Naf (C2^ 20On). 1H NMR (DMSO-d6, 500 (1H; m - H-7); 1,80 (1H; m; H-7); 2,09 (1H; m; H-8); MHz): 6,75 (1H; S’, H-3); 6,44 (1H; d; 2,5 Hz; H-6); 6,79 1,60 (1H; m; H-11); 1,53 (1H; ró; H-11); 2,11 (1H; m; <1H; d; 2 Hz; H-8); 7,42 (1H; d] 2 Hz; H-2'); 6,83 (1H; d\ H-12); 2 04 (1H; m; H-12); 2,91 (1H; d; 17 Hz; H-14); 8 Hz; H-5 >; 7,46 (1H; dd; 8 Hz; 2 Hz; H-6’); 5,08 (1H; 2.50 (1H; Ớ, 17 Hz; H-14); 4,38 (1H, d; 9 Hz; H-16); d, 7,5 Hz; H-1"); 12,99 (1H; s; 5-OH). lãÒ NMR 4,19 (1H, d; 9 Hz; H-16); 0,80 (3H; Ớ; 7,0 Hz; H-17); (DMSO-d 6 125 MHz): 164,5 (s; C-2); 103,2 (Ơ; C-3); 0,95 (3H; s; H-18); 0,98 (3H; s; H-19); 1,23 (3H; s; H- 181,9 (s; C-4); 161,1 (s; C-5); 99,5 (ơ; C- 6); 163,0 (s; 20); 2,04 (3H; s; H -22)*C NMR (CDCI3 125 MHz): C-7); 94,7 (d; C- 8); 157,0 (s; C-9); 105,3 (s; C-10); 34,2 (t C-1); 18,7 (t, C-2); 43,9 (f; C-3); 34,1 (s; C-4); 121.4 (s; C -1); 113,6 (Ơ; C-2’); 145,8 (s; c~3’); 149,9 48.8 (Ơ; C-5); 70,4 (Ớ; C- 6); 29,3 (f; C-7); 31,2 (Ơ; C- 8); (s; C-4’); 116,0 (d; C-5’); 119,2 (Ơ; C- 6’); 99,9 (d; C -ry 93 9 (s; C-9); 42,8 (s; C-10); 36,5 (f; C-11); 37,8 (f; C- 73,1 (s; C-2"); 76,4 (s; C-3”); 69,5 (s; C-4"); 77,2 (s; C- 12); 85,8 (s; C-13); 42,9 (Í; C-14); 174,9 (s; C-15); 78,4 5''); 60,9 (i; C- 6”). (f; C-16); 17,2 (ợ; C-17); 33,1 (q: C-18); 23,8 (q; C-19); Chat v6: bột màu vàng. ESI-MS: m/z 447,62 [M-Hf, 19.8 (ợ; C-20); 170,5 (s; C-21); 21,9 (ọ; C-22). 471.75 [M +Naf (CnHsoỏn). 1H NMR (DMSO-de, 500 Chất v 3: bột vi tinh thể, màu trắng. ESI-MS: m/z MHz): 6,67 (1H; s; H-3); 6,48 (1H; s; H-8); 7,39 (1H; d; 455,96 [M-H]- (C 3oH480 3). 1H NMR (CDCI3 và MeOD, 2 Hz; H-2’); 6,89 (1H; d; 8 Hz; H-5'); 7,42 (1H; dd; 8 500 MHz): 1,08 (1H; m; H-1); 2,17 (1H; m; H-1); 1,27 Hz; 2 Hz; H-6’); 4,59 (1H; d; 10 Hz; H-1”). 13c NMR (2H; m; H-2); 3,21 (1H; Í; 9 Hz; H-3); 0,72 (1H; Ơ; 11 (DMSO-de, 125 MHz): 163,6 (s; C-2); 102,8 (ổ; C-3); Hz; H-5); <54 (2H; m; H-6); 1,62 (1H; m; H-7); 1,32 1818 (s; C-4); 160,7 (s; C-5); 108,8 (s; 0 6 ); 163,2 (s; (1H; m; H-7); 1,08 (1H; m; H-8); 2,17 (1H; m; H-8); C-7); 93,5 (& 0 8 ); 156,2 (s; C-9); 103,4 (s; C-10); 1.51 (1H; m; H-9); 1,90 (2H; m; H-11); 1,59 (2H; m; H- 121.4 (s; C-V); 113,3 i'd; C-2’); 145,7 (s; C-3’); 149,7 15); 1,64 (2H; m; H-16); 2,19 (1H; Ớ, 6 Hz; H-18); 1,33 (s; C-4’); 116,0 (&, C-5'); 119,0 (6; C-6'); 73,0 (d; C-1"); (1H; m; H-19); 1,33 (1H; m; H-20); 1,25 (2H; m; H-21); 70,6 (d; C-2”); 78,9 (Ô; C-3”); 70,2 (ứ; C-4”); 81,5 (d; C- 1,63 (1H; m; H-22); 1,71 (1H; m; H-22); 0,98 (3H; s; H- 5”); 61, 5 ft; C-6”). 23); 0,81 (3H; s; H-24); 0,91 (3H; s; H-25); 0,77 (3H; s; Chất v9: bột vi tinh thể màu trắng. ESI-MS: m/z H-26); 1,09 (3H; s; H-27); 0,86 (3H; Ơ; 6,4 Hz; H-29); 165,78 [M-Hĩ; mỉz 189,71 [M +N af (C9hi10O3). H NMR 0 96 (3H; c/; 6,4 Hz; H-30). 13c NMR (CDCIa Và MeOD, (CDCk 500 MHz): 7,96 (2H; d; 4,5 Hz; H-2, H-6); 6,88 125 MHz): 38,8 (A C-1); 28,2 (Í; C-2); 79,0 (d, C-3); (2H; d; 4 5 Hz; H-3, H-5); 4,36 (2H; q; 7 Hz'; H-21); 1,38 39.6 (s; C-4); 55,4 (d; C-5); 18,4 (t, C-6); 33,2 (/; C-7); (3H; t; 7 Hz; H-3’); 6,40 (1H; s; 4-OH). 13c NMR 38.8 f; C- 8); 47,7 (d\ C-9); 37,2 (s; 0-10); 23,4 (t, C- (CDCh, 125 MHz): 122,7 (s; C-1); 131,9 (d; C-2, C-6); 11); 125,7 (s; C-12); 138,3 (s; C-13); 42,2 (s; C-14); 115,3 (ó; C-3, C-5); 160,2 (s, C-4); 167,0 (s; C-1’); 61,0 27,0 (t; C-15); 24,3 (i; C-16); 47,9 (s; C-17); 53,0 (d; C- ậ;C-2’);14,3(q;Ó-3’). 18); 39 2 (d; C-19); 39,0 (ớ; C-20); 30,8 (í; C-21); 37,0 Chắt v 10: bột vi tinh thể màu trắng, sắc ký lớp (/; C-22); 28 1 (ợ; C-23); 17,0 (ợ; C-24); 15,5 (ợ; C-25); mỏng so sành với sĩtosterol-3-0-$-glucosid cho thay 15.7 (q; C-26); 23,6 (<7; C-27); 180,7 (s; C-28); 17,1 (q; v 10 trùng với sitosterol-3-0-$-glucosid. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời ba có độ tinh khiết sắc ký (UPLC) iần iượt ià 99,35%, flavonoid castỉcin^ cynarosid và isoorientỉn trong 99,30%, 99,42%. !á Quan âm biển băng phương pháp UPLC-PDA Qua khảo sáí rất nhiều hệ dung môi khác nhau, Các chất đối chiếu isoorientin, cynarosid và casticin nhận thấy chương trinh rừa giải được trinh bày ở bảng -663 -
3. W a*t- 1 chò kểt quả phân tích tốt nhát, sắc ký đồ mẫu thử và ................................. Ị độ tinh khiết pic của các chất cần định lượng lần lượt Isoorientin ccrtvj [ Cynart >sid được trinh bày ở hình 2 và hình 3. I Ctf<H Thời gian Nừớc Aceíoniỉril -3 ] Casticin (phút) acid formic 0,2% thêm acid formic 0,2% 0 91,3 8,7 , 27 90,8 9,2 d 0Ô1M 1 i 28 66,5 33,5 _, L_a . .. .... , / U . A ___ ______ Ì W_JL_ 38 66,5 33,5 O.ÍO !CO to 1505 ’»» tf'oj »9» 03 39 10 90 M ittal 44 10 90 Hình 2. Sắc kỷ đồ của mẫu thử vói chương trình rủa giải được chọn Tốc độ dòng: 0,15 ml/phút; Nhỉêt đô côt: 40 °c ■'.'tìOĨ i I. ■ ' ■ . • • • • ' . :• • • «•' V'Kk -- - 11 :.... I'*-.*. ■ • 'x! ? in •woo 5 : B 1 -<Hv ■ 5 1 8 1 o t , ? * ■ 1 .t 1 I 5 ' ^ ' \ , ■ . V ' ■ r % ,• ■ '■iV. . J- :'ề ■ PA: PAi. 1.430 TH: 2,950 : C.391 TK . 0 872 --ụ— SO . PeefcCYN ■— ~ 'P ia k CAS: V- PurĩV/ ■. -- -- puMy . . :Duní/ . ...V..., Au»Th«iholơ Avt&Th**0ld —^— fru»Tft»Mhữ1d • Hình 3. Độ tinh khiết pic của các chẩỉ cần định iipợng Dựa vào bước sóng hấp thu cực đại của các chất - Tốc độ dòng: 0,15 mí/phút; nhiệt độ cột: 40 °C; thể đối chỉéu, chọn bước sóng 349 nm íàm bước sóng tích tiêm: 0,7 ỊJ|; phát hiện đồng thời ba fiavonoid này khi định lượng. Hàm lượng mỗi chẩt isooríeníin, cynarosid hoặc Các tốc độ dòng khác nhau cũng đã được khảo sát casticin được tinh íheo công thức (0,17 ml/phút; 0,2 ml/phứt; 0,25 mí/phút; 0,30 ml/phút); St kết quả cho thay với tốc độ dòng trên 0,15 mỉ/phút, x C c x X /? x l0 0 khổng đạt độ tinh khiết pic cho cả 3 chất cần định Sc m ( 1 — h ) lượng nên không thể rút ngắn íhời gian phân tích bắng Trong đó: cách tăng íốc đọ dòng. X: hàm lượng isoorieníin, cynarosid hoặc casticin Quy trình chuẩn bị mẫu cũng đã được khảo sát trong dược liệu (%) (dung môi chiết, thời gian chiết, so lần chiết). Sc: diện tích pic thu được của mẫu chuẩn (ụV X Quy trình định lượng giây) Chuần bị mẫu: Cân chính xác khoảng 50 mg bột lá st: diện tích pic thu được của mẫu thử (ụV X giây) Quan âm biển cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp, Cc: nồng độ của mẫu chuẩn (mg/m!) thêm 15 ml methanol 90%, siêu âm (mức năng lượng k: độ pha loãng của mẫu đo sóng siêu âm 100% thiết kế của máy) ờ nhiệt độ 60 °c m: khối lượng dược liệu (mg) ± 2 °c trong vòng 30 phút, sau đó lọc íấy dịch, rửa bã h: độ ẩm của dược íiệu (%) dược liệu bằng 5 ml methanol 90%, gộp chung vào p: đọ tinh khiết cua chất đoi chiếu (%) dịch lọc, cô đển cắn. Hòa cắn bằng methanol 90% cho Quy trình được đánh giá theo hướng dẫn thẩm vằo bình định mức 5 mỉ, thêm dung môi cho đủ thể định quy trình phân tích, kềt quả đạt được những yêu tích bình, lắc ổều, lọc qua màng iọc PTFE 0,2 pm. cầu đặt ra của một quỵ trình định lượng (phụ lục 2), cụ Điều kiện sắc kỷ thể như sau: - Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Waters model Isoorierrtin Cynarosid Casticin UPLC Acquity H-Class; đầu dò PDA, bước sóng phát Khoảng íuyến tính (Mg/m!) 1-100 1-100 0,4-100 Độ đặc hiệu Đạt yêu cầu hiện: 349 nm; cột sắc ký: Acquity UPLC® BEH C18 Độ lặp ỉại Đạt ýêu cấu (130Â; 1,7 ụm; 2,1 mm X 50 mm); Độ đúnq Đạt yêu câu - Chương trình rừa giải LOQ (Hg/ml) 4,05 0,62 0,41 Acetonitril thêm acid Thời gian Nước acid formic .. .LOD(Mg/ml) 1,33 0,21 0,13 (phút) 0,2% formic 0,2% Kết quả hàm lượng các flavonoid isoorientin, 0 91,3 8,7 27 90,8 9,2 cynarosid, casticin trong íá Quan âm biển iần !ượt là 28 66,5 . 33,5 0,35%, 0,10%, 0,08%. 38 66,5 33,5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 10 90 Các đặc điềm hình thái thực vật và vi học của các 44 10 90 bộ phận rễ, thân, lá, quả Quan âm biền đa được mô -664-
4. tả. Từ lá Quan âm biển, 7 chất tinh khiết đã được phân chùm xim ở ngọn cành và xim hai ngả ở nách lá. Hoa lập và xác định cầu trúc: casticin (Vi! 2012,34 mg), lưỡng tính, không đều, màu xanh tím. Đài 5, đều, dính previtexilacton (V2; 815,42 mg), acid ursolic (V3; 208,62 nhau thành một ống, phía trên chia 5 răng hình tam mg), ethyl paraben (V9; 308,66 mg); 3-0-Ị3-D- giác, tiền khai van. Tràng hoa không đều, dính nhau glucopyranose sitosterol (V10; 245 mg); cynarosid (V5; thành ổng, trên chia hai môi 2/3, tiền khai năm đềm. 30 mg) và isooríentin (V6; 46,39 mg). Quy trinh định Bộ nhị 4 nhị, kiều hai trội. Bầu trên, 4 ô, mỗi ô 1 noãn, lượng đồng thời ba fiavonoid casticin, cynarosid và đính noãn trung trụ. Quả hạch hình cầu, quả non màu isoorientin trong lá Quart âm biền bằng phương pháp xanh, khi chín màu vàng, quả khô màu đen, phủ nhẹ UPLC-PDA đã được xây dựng và đánh giá. Kết quả một lớp lông tơ màu xám nhạt. Đài tồn tại màu trắng hàm lượng isoorientin, cynarosid, casticin trong lá bạc bao bọc khoảng 2/3 quả. Hạt 1-2, màũ trắng xám. Quan âm biển lần íượt là 0,35%, 0,10%, 0,08%. Mẫu nghiên cứu đừợc xác nhận là vitex rotundifolia L. TÀI LIỆU THAM KHẢO f.t Lamiaceae. 1. Raven p. H., Zhengyi w ., Zhenghi w . (1994), 2. Đặc điểm v i học Flora of China Illustrations, Vol. 17 (Verbenaceae Rễ through Solanaceae), Science Press, Beijing, and Vi phẫu tiết diện tròn. Bần aồm nhiều lớp tế bào Missouri Botanical Garden Press, St. Louis, pp. 1, 28- hình chữ nhật vách uốn lượn xễp đồng tâm và xuyên 32. tâm. Lục bi vài lớp tế bào hình chữ nhật, thường ép 2. Rani A. và Sharma (2013), “The genus Vitex: A dẹp. Mô mềm vỏ khuyết gồm các tế bào đa giác gần review”, Pharmacogn. Rev., 7(14), 188-198. tròn, vách hơi uốn lượn. Nội bì khung Caspary. Trụ bì 3. Ajay Kumar Meena, u. s. Niranjan et al (2011), 1-2 lớp tế bào, rải rác vài tế bào hóa mô cứng. Libe gỗ “A review of the important chemical constituents and kiểu hậu thể lien tục. Libe1 tế bào nhò, xếp lọn xộn, bị medicinal uses of Vitex genus”, Asian Journal of ép sát vào trụ bi. Libe 2 gồm các tế bào hình chữ nhật Traditional Medicines, 6 (2), 54-60. vach uốn lượn xếp xuyen tâm. Gỗ 2 gần chiếm tâm. 4. Meena A. K., Singh u. et ai (2010), Gỗ 1 rải rác dưới tia tùy. Mô mềm tủy đạo hóa mô '‘Pharmacological and phytochemical evidences for the cứng gồm các tế bào đa giác gần tròn, kích thước khá extracts from plants of the genus Vitex - A review", đều. Bột rễ màu nâu xam, không mùi. Thành phần International Journal of Pharmaceutical and Clinical gồm: mảnh mô mềm, mảnh bần, cụm mô cứng, hạt Research, 2 (1), 1-9. tinh bột, mạch điểm 5. Padmalatha K-, Jayaram K. et al (2009) Thân “Ethnopharmacoiogicai and biotechnological Vi phẫu íhân non tiết diện vuông, thân già có tiết significance of Vitex'1, Bioremediation, Biodiversity and diện tròn. Biểu bỉ có lớp cutin mỏng, có nhiều lông che Bioavailability, 3 (1), 6-14. chờ và lông tiết. Mô dày góc tập trung nhiều ở các góc 6. Ganapaty s., Vidyadhar K. N. et al (2005), lồi. Tầng phái sinh bần-lục bì hình thanh sớm trong lớp “Phytoconstituents and biological activities of Vitex - a mô dàyT Mô mềm vỏ đạo. Trụ bì hóa sợi thành từng review1’, Journal of natural remedies, 5 (2), 75-95. đám không đều. Libe gồm các tế bào nhò, xếp lộn xộn 7. Ghada Ahmed Fawzy, Areej Mohammed Ai- thành cụm dưới trụ bì. Libe 2 gồm các tế bào hình chữ Taweel et al (2012), “Cytotoxic and renoprotective nhật xếp ổồnạ tâm và xuyên íam với gỗ 2. Hậu thể liên flavonoid giycosides from Horwoodia dicksoniae", tục. Gỗ 1 nhieu. Mô mềm tủy tế bào gần tròn, hóa mô African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 6 cứng, càng vào tâm càng to. Bột thân màu xanh xám, (15): 1166-1175. mùi thơm. Thành phần gồm: lông che chở, mảnh bần, 8. Gnoatto S.C.B., Dassonvilie-Klimpt A et al mạch điểm, mạch vòng, mạch xoan, mạch vạch. (2008), “Evaluation of ursolic acid isolated from Ilex Lá paraguariensis and derivatives on aromatase Gân giữa inhibition”, European Journal o f Medicinal Chemistry, Mặt dưới lồi tròn, mặt trên hơi lồi. Trên biểu bì thỉnh 43:1865-1877. thoảng gặp lỗ khí, nhiều lông che chờ và rải rác có 9. Jinyong Peng, Guorong Fan et al (2005), lông tiết Mô dày góc hoặc có khi mô dày tròn. Mô “Preparative separation of isovitexin and isoorienỉin mềm đạo. Cung íibe-gỗ với gỗ ở ỉrên iibe ở dưới. Phía from Patrinia villosa Juss by high-speed counter- trên gỗ có 5-7 cụm libe kích thước không đều, đôi khi current chromatography”, Journal o f Chromatography gặp vài mạch gỗ trên các cụm iibe này. A, 1074: 111-115. Phiến iá 10. Kondo Y., Sugiyama K., Nozoe s. (1986), Lông che chở có ở hai lớp biểu bì nhưng nhiều “Studies on the constituents of Vitex rotundifolia L. fil.", hơn ở biểu bi dưới. Trên biều bi rải rác có lông tiết. Hạ Chem. Pharm. Bull., 34: 4829-4832. bì gồm 1-2 lớp tế bào hình chữ nhật hoặc đa giác, kích 11. Nurgun Kucukboyaci, Bilge Senner (2010), thước lớn. Mô mềm giậu hơi lấn vào vùng gân giữa. “Two major flavonoids from the fruits of Vitex agnus- Mô mềm khuyết gồm 2-4 lớp tế bào tròn hoặc bầu dục, castus L ., TurkJ.Pharm. Sci., 7(2): 119-126. kích thước không đều, xếp lộn xộn. Bó ỉibe gỗ của gân Phụ lục 1. Kết quả khảo sát thực vật học ioàỉ phụ gồm 3-4 mạch gỗ rất nhồ ở trên, libe ở dưới. Quan ẩm biển nghiên cứu Bột lá màu xanh xám, mùi thơm, vị cay. Thành 1. Đặc điểm hình thái phần gồm: lông che chở, mảnh biểu bi mang iông che Cây gỗ nhỏ, mọc bò hoặc thành bụi. Lá đơn, mọc chở và lỗ khí, mảnh biểu bì - hạ bì mang lông che đối chéo chữ thập, hình bầu dục hơi tròn. Cụm hoa chờ, lông tiết, mảnh mô dày, sợi. -665 -
5. Quả Rễ Vi phẫu quả có tiết diện tròn, có 4 ngăn to nhỏ không đều, mỗi ngăn chứa một hạt nhưng thường 1-2 ngăn bị lép. Biểu bì có lớp cutin khá dày, mang nhiều iông tiết, đôi khi gặp iông che chở đa bào rải rác. Mô dày góc. Mô mềm đạo, khi còn non vách cellulose mỏng, về già những ỉớp tế bào ở phía trong vách dần hóa gô. Trong vùng mô mềm rải rác có các bó dẫn phụ nằm thẹo mọt vòng gần tròn với libe ở ngoài, gô ơ Mõ mèm vó trong. Tiếp theo ỉớp mô mềm là nhiều iớp tế bào mô ể S cứng càng vào phía trong vách càng dày. Biểu bì trong của vỏ qua ỉà một lớp tế bào vách cellulose mòng gồm các tế bào rất nhỏ hình chữ nhật khá đều. Chính giữa A quả có các bó dẫn chính rất đặc trưng, vỏ hạt cấu tạo bời 1-2 lớp tế bào hình chữ nhật hơi thuôn hoặc hình bầu dục vách hóa gỗ hình mạng lưới. Nộỉ nhũ gồm các tế bào hlnh chữ nhật hoặc bầu dục ờ phía ngoài và hình đa giác vách uốn lượn ờ phía trong, vách ceílulose mỏng chứa nhiều hạt tinh bộí. Khối phôi gồm M6 mèm lứy cảc tế bào hình đa giác, vách mỏng bằng cellulose không chứa nhiều tinh bột như nội nhũ. Bột màu đen xám, mùi thơm, vị cay. Thành phần gồm: Tế bào mô Hình 2. Vi phẫu rễ Quan âm biển cứng, mảnh vỏ quả, mảnh vỏ hạt, mảnh nội nhũ, mạch vạch, mạch điểm, hạt tinh bột, lông che chở, manh biểu bỉ mang lông che chở. Hoa thức và hoa đồ I) Hình 3. Các cấu tử trong bột rễ Quan âm biển A. Mảnh mô mềm; B. Hạt tinh bột; c. Cụm mô cứng; D. Mảnh bần; E. Mạch điểm h I g b I b R . Ị t ® Hình 1. Đặc điểm hình thái cây Quan âm biển A. Thân bờ; B, c. Lá; D. Cụm hoa; E. Hoa; F. Hoa được tách để ỉhầy rõ nhị và nhụy; G. Nhụy; H. Nhị dính vào cánh hoa; í. Hạt phấn; J. Quả -666-
6. Thân — *. 3i\n ------ — ► i.ục lii M ô dìiỵ Mỏ mềm vò — ► Cụm riiẠcímK - i.ibc 1 H — — •* Lìbti 2 Ww* — Tia libc f j r * | i í \ ° Hình 7. Các cáu tử trong bột lá Quan âm biển A, B, c, D. Các dạng lông che chở; E. Mảnh biểu bi mang lông che chở và !ô khí; F. Sợi; H Mảnh biểu bì mang lông ché chờ; G. Lông tiết; H. Mảnh mô dày Quả ì J b "■— H i p i Mụclĩ ỵỗ i Ig^gặặl pL '— Mò mồm £ỗ ỉ -■- Mỏ mèm tùy Hình 4. Vỉ phẫu thân Quan âm biển 4ế$@$ìlk §#ĩlfPÌKầ. C'^4 Jliwlll; JfSlililk J i l l ÊÊSm ẵíấ ẵiSSliâ I I • «11 ifH ® ill ll|ip i ^IlllliiP^ §ỉl ì l\ r ; 1 i ( .I - Lóiialiữt - iìiứu bl (Vỏ <rà ngoài) V fểmỆÍỆ$fSllillllll iilllilt II Xỷỵ-ịỳỊiị^ặtẻẬ illit^llp 1 ! — Moment c - w ^ ( *1 1.1J1.1[_... N v. y7S •í* x.,< ’*■ ’ Hình 5. Các cấu tử trong bột thân Quan âm biển A; B. Lông che chở; c. Mảnh bần; D. Mạch điểm; - Mò mèm vAch lión gò E. Mạch vòng; F. Mạch vạch; G. Mạch xoắn Lả ' Mồ cirniỊ 'ộibi(Vồ<|iù(rc»g) ò !>at illilũ 1Ú mím Hình 8. Vi phẫu quả Quan âm biển I \ Hình 9. Các cấu tử trong bột quả Quan âm biển A. Tế bào mô cứng; B. Mảnh vỏ quả; c. Mảnh vỏ hạt; D. Mảnh nội nhũ; E. Mạch vạch; F. Mạch điểm; G. Hạt tinh bột; H. Lông che chở; I. Mảnh biểu bỉ mang lông che chở Hỉnh 6. Ví phẫu phiến iá Quan âm biền -667-
7. Phụ lục 2. Kết quả đánh giá quy ỉrình định lượng đã xây dựng 1. Tính tư ơiig thích hệ thống XD QAB tuong thich he thong Mau Ibu Oato Acquired: »12/201523321 AM ICT; Vai: l:n,4; Channel PDA 349 0 nm Maư thu Date Acquiosd: »12(3015 3:24:06 AM 1CT; Vial: la.1; Channel: PDA 3-I9.0 nm MoulhulOm g/m i; OnteAcquired: W12/20IS41447 AM ICT; Viol: 1:0,4; Channel:P DA349.0tro Mau thu 10mg/inl; Date A a jw e ii: »1212015 &052C AM ICT; Vial: 1:a/1; Channel. PDA 3*19.0 nm Mau Uui 10mstoii. Date Acquired: aiZ20155:56;12/>M ICT; Vial: 1:0.4; ctianne!: PDA 349.0 ITT) M oulhulO m giirt; ŨoEe Acqufrcd: 0^12/20160:4047 AM ICT, Viol: 1:a.4; Channel POA 349.0on System Sutiabllity Separation Results N a m e : C A S Retention Tim® A na Nam* K Pflm * USP Plal» Count Stltetlvlty R*«4>lutlon Symmtay Factor (mĩn) teVsocJ CAS 37.294 Ì015Q7 e.Ô3ữS!âo*C0) 1.£M9435e*005 1.107673<5*000 1427816^001 t.GtõlTDe^OCO CAS 37.287 101060 0M6258e*lXJ1 1.921675e*0QS 1.107«Bc*000 1.«2109o*»1 1.Đ!832Gc*000 3 CAS 37.267 1017Ỡ4 6»149!e*K)1 1,B77208c»«>5 tWTCOQcKXX) i-nwr-kHOJi 1.017B66e*000 CAS 37.260 10101S 6.930)930*001 1.979!70e*005 1.107102e-*t»a 1,427584fr*C01 9S15&363O-001 6 CAS 37270 102399 6.932000c* 001 1.9S«ri9c*OQ5 i.io7We*ooo 1.4161060-001 1.0l6278e*000 B CAS 37.273 102396 6.93271le*001 1.W5M3c*OOS 1107349®*«» 1.4i0381e*a)1 1.0I2903c*000 Msan 37.3 1016886 6.9e*OB1 1.9e«OOS 1.ỊCH100 14c *001 1.0c*000 %RSD B.o 0.6 3SS-002 1.96*000 1 .^0 0 2 s.0e-001 7.0C-CŨỈ System Suitability Separation Results _______________ N a m e : C V N _______________ R«t«nti<m T ỉm * Area Nome K Prime USP Plate Count Selectivity R«solutton Symmetry Factor ítnin) ftiVM C) CYN 22.784 S5198 4.1S8868e«X)1 a»5S S 5e*a» 1.149525**000 3.650002c-'ox* 944S740&001 CYN XtfữS 57053 41B87S0e*001 9.2449816*003 1 149225e*000 3.518406c*C00 1.08lT88iT*t>a) CYN 22.507 63983 4 t400!8c*D01 0.«2380e* 3 I.16e373c*000 SSMOOOC'OOO 1.0711B5c«X» CYN 22.42S SSSiS ■» J312I&HXM 8890«Mo«a» 1 167S24e*000 3.545577e*a» 1.a»TMe«-000 6 OTI 22424 &16S0 4.131035e*D01 6S902386e<003 1.158854^000 3£84367e^COO l.MI/'Mc^OOO 6 CYN 22.309 56364 4,120601e«001 e.8998S6<K»3 1.1SCS9te*000 3£14l03e*a» Ĩ.OỮ9Ũ52e*ỮOO Mean 225 65530.8 4.1C+001 9.1&HXJ3 12e*0Q0 3.&!*000 1.1e*0® % RSD 0 7 z o 7.1&OJ1 1.9e*000 3.9®«)! 1.4CG0Q 5.3c* IXO Reported by User System Project Name: XuanDieu Report Method; XD QAB tuong Ihich he Ih Date Printed: Report Method I 6090 9/19/2015 Page: 1 of 7 1:55:10 PM As!a/Ho_Chl_Mlnh
8. 1. Tính tương thích hệ ỉhống (tiếp theo) Sample Set: XD QAB KS so lan chiet General Inform ation Sample Set Name XD QAB KS solan cliiet Sample Set Altered No Sample Set Method XD QAB KS solan chiet Sample Set Acquiri ng No Sample Set start Data 9/11/2015 4:22:33 PM ICT Sample Set Type Acquired Sample Set Finish Date 9/12/2015 7:36:50 AM ICT Sample Set Current Id 3705 Sample Set Id 3705 Sample Set Comments Sample Set Acquired By System System Suitability Separation Results N am e: ISO Retention Time A re a N a m e K P rim e USP Plate Count Selectivity R e s o lu tio n SyrwnetryFactor (m ln ) ( p V s e c ) 1 ISO 9 .9 2 2 42 2Ũ 0 5 1.7720096*001 7.1874479+003 9.9573858-001 2 ISO 9 .8 9 8 4 2 0 4 5 0 1.767633e+001 7.263419O+003 1.01S324S+000 3 ISO 9 .8 2 8 4 2 2 8 3 3 1.7542926+001 7,204S48e*003 9.9323630-001 4 ISO 9 .7 5 8 4 2 3 0 2 0 1.7410356-* 001 7.158147«+003 9.879812S-001 5 ISO 9 .7 6 0 4 2 4 2 1 2 1.74152Se+001 7.31633Se*003 9.33S6B2e-001 6 IS O 9 .7 0 2 4 2 3 4 0 3 1.730552e-*001 7.2253566*003 3.971S04O-Ũ01 M e a n 9.3 4 2 2 5 5 3 ,5 1 .8 6 *0 0 1 7 .2 8 + 0 0 3 1 .0 8 * 0 0 0 % R S D 0 .9 0 .3 s .3 e -0 0 1 7,9e -0 01 1 .1 6 + 0 0 0 Reported by User; System Project Name; Xuan Oieu Report Method: XD QAB tuong thich he th Date Printed: Report Method I 6090 9 /1 9 /2 0 1 5 Page: 2 of 7 1:55:10 PM Asia/Ho_Chi_Minh 2. Độ đặc hiệu x p QAB do dac hịẹu o.oso o.oso 0U?O Q0GÚ 0,060 ? 0040 0 030 0.020 0 0U> occo -0.010 ooo 503 ỈOCO ISOữ 20 03 26 CO 30X0 3S.C0 4000 -«.00 5000 Minutes ----------- mau trang: Channol: POA 349.0 nm — ..... HH Oman 30 ppm; Channel: PDA 349.0 nm 1 0 m g /m ! 30 lap lal 1: Channel: PDA 349.0 nm ----------- 120-1; Channel: PDA 349.0 nm System Suitability Separation Results _________________________________________ N a m n : C A S ____________________________________________________________ Synretry Pưtyl Punf/1 SarrtfeNimc Name RT KPnme USPPJMcCapt ScScctiUty Rc&ctuâcn Píiclar Angle ThrcshoW t !0 rTQ/ni lop Id 1 CAS 07,271 60-32330G 1.»#3C3?»C06 t10740Se+000 HGM60Ỗ 1.0087» 0.-4C0 0,eS2 2 120-1 CAS 37 325 60.42S45S I9I&4S10-CD6 M08U3Ú+C00 1‘1<33W5Ê I.C0S70T 0.2M 0772 3 HH cruan3ữflxn CAS 37.209 0$.37K£0 1.95S/70C* CC6 t.G524ỉ5**tt)0 2M0GG64 1.COS534 0.076 02Ỉ6 System Suitability Separation Results ________________N a m o i C Y_______________ N SyrrWy Purifyl Pư&y1 ScrTơcNaro Hvrc RT K Prime USP Plate Cart ScttKOvty Rescfubcn Faster ArtQie •(treaftoH 1 lũrsộ/rrt ĩ CYH 21009 40.140450 8,l»uee*003 1.t71460**<x» 1.0C&125 M12 3Q10 2 120-1 CYU 223S2 41.1744*7 &«J7&«Se*OCO 1.183l&*c*CC0 02722« Í.07ỄSC4 0,000 2.002 3 HM Chuủnãỡppm CYN 2z?$i41,393044 /i9y780e»DCC 2324567e*ax 16330571 *03235* OẳSữ 0262 System Suitability Separation Results ' _____________N a m e : IS O________________ Sywr*cy Fuly1 Punvi SarựcNarre Nam0 RT KPnme USPPaatữCcư* Seỉecíuỉy Rcsduucn Facío» A^e Ttv«*« 1 19 L)p lai 1 ỈSO *£M I7CPG&52 773í»So-«0 0 9Ô4342 0.3 w 0.415 2 1JO-1 ISO 9.651 172IŨC66 ?.3&7974e+ao o.seecoi 0218 0433 3 HH ÍSO 10 ICC Í8CC0C02 7 74?64CC»Cữ3 101009? 0 079 0212 Reported by Usor System Project Nome: Xuan Dleo Report Malhod: XD QAB âo ciac hlau Date Printed: Report Method I S487 3/17/2015 Pago: 1 0f5 3:57:54 PM A3a/Ho_Chl_Mlnh -669-
9. 3. Độ iặp lại XD QAB do lạp lai 0.040- 0.030- M !!■ Ệ n - 0 .010 - J , .... ■■.. “■••2 • • ■'!..< ■ ■' 5 " - Éổ ĩ iff; I © • -. rt >■ 0.000- • 0.00 5-Ó0 101» 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 Minutes 10 mg/ml do !ap b i 1; Date Acquired: 9/16/2015525:57 PM iCT Vial:1:A,4; Channel; PDA 549,0 nm 10m gfm idotaplai2; Date Acquired: 9/16/2015 6:16:40 PM ICT Vial; 1:1),4; Channel: PDA 349.0 nm 10 mg/m! do iap lai 3; Date Acquired: 9/16/2Ữ15 7:07:24 PM ICT Vial: 1:c,4; Channel: PDA 349.0 nm 1Q mg'ml do iap iai 4; Date Acquired: 9/182015 7:58:07 PM !CT Vial:1:d,4; Channel: PDA 319.0 nm 10 mg/ml do lap lai 5; Date Acquired: 9/16/2015 8:48:51 PM iCT Vial:1:e,4; Channel: PDA 349.0 nm 10mg/m!đolapiaì6; Date Acquired: 9/16/2015 9:39:34 PM ICT; Vial: Channel: PDA 349.0 nm System Suitability Separation Results Name: CAS Retention Time Area Name K Prime USPPlaleCount Selectivity Resolution SymmetryFactor (min) {(jVsec) 1 CAS 37271 106045 6S32331&H)01 1.933392e*OQ5 t.107465e+000 1.404469e*001 1.009754e+000 2 CAS 37266 103999 6.931402e*001 1964S33&KXS 1.107433e«X)0 1.411834e*001 1.010149eKXM 3 CAS 37.321 100459 6.&t1678e*001 1.925732e*005 1,108341eK)00 1,428276e+00l 1.009CS9&KXX) 4 CAS 37.370 105107 6.95102<1e^001 1.894276e+005 1-10S44Se+000 1.441127e*€01 1.009616e+000 5 CAS 37.347 1D40Q2 6.946S13e*001 1.917846éK)05 1.108206fr*000 1.438013e<001 1.010579e*a» 6 CAS 37.327 1Q2999 6542764et001 1.926985e+005 t.107906e+000 1.432B46e+001 1.021875e*0C0 Mean 37.3 103768.5 6-9e*C01 1.9e*005 1.1e-KM0 1.4eK»1 1.0erH300 %RSD 0.1 2J) 1.1&001 1-2&HXX) I.OeHDOO 4.9e-001 System Suitability Separation Results Name: C Y N _________ Retention Time Area Name K Prime USPPIateCount Selectivity Resolution SymmeiryFactor (min) (yVsec) CYN 22.729 57680 4.188496e*OD1 1.130237e«m 1.1527&4e+000 3.6E0197e+000 9.885176&001 2 CYN 21.978 55898 4.014946e*001 8.159146e*003 1.171460e+000 a-534888e+000 1.035425e+0ũ0 3 CYN 21.883 54299 4/328945e*001 7.953848frH)03 1.17Z359e*000 3-568096e*000 1.024926c*0QQ 4 CYN 22268 56024 4.1393«eK»1 8.052578e«a» 1.1S5540e*000 35CS040eH)00 1.M 070M ŨŨ 5 CYN 22.910 57017 4224233eH101 1.146627eHXM 1.1466216+000 3559819eK»0 9.775597e-001 6 CYN 22843 56078 4.209a20eKI01 1228419e*004 1.147931et000 3.5453406*000 1.033B04e+000 Mean 22.4 56166.0 4.1ÍH001 9.9e*003 1.2eHX)0 3.5&*000 IGíHOOO %RSD 2.0 20 2.2e+000 2.0B+C01 2.0e+000 3.8eHX» Reported by User System Project Name: Xuan Dleu Report Method: XD QAB do lap lai Date Printed: Report Method I 5699 9/18/2015 Page: 1 of 7 8:49:13 AM Asia/Ho_Chi_Minh -670-
10. 3. Độ Ịặp lại (tiếp theo) Sample Set: XD QAB do lap lai General Information Sample Set Name XD QAB do lap lai Sample Set Altered No Sample Set Method XD QAB do lap lai Sample Set Acquiring No Sample Set start Date 9/16/2015 5:25:21 PM ICT Sample Set T ype Acquired Sample Set Finish Date 9/16/2015 10:29:36 PM ICT Sample Set Current id 4799 Sample Set Id 4799 Sample Set Comments Sample Seỉ Acquired By System System Suitability Separation Results Name: ISO Retention Time A rea N am e K Prim e USPPỈateCounĩ Selectivity R e so lu tio n (m in) (ỊjV*sec) SymmetryFactor 1 ISO 9.936 437198 1.774666e+001 7.227525e+003 9.959533e-0Q1 2 ISO 9.935 429501 1.774480e+001 7.585707e+003 9.936925e-001 3 ISO 9.617 411199 1.714585e+Q01 7.721932e+003 9.95792DÔ-Ũ01 4 ISO 9.794 428019 1.7479656+001 7.213374e+003 9.850193e-001 5 ISO 9.871 429Q10 1.7623716+001 7.398966e+003 9.974120e-001 6 ISO 9.544 425998 1.7006856+001 7.731299e+003 9.843419e-001 Mean 9.8 426820.8 1.7e+001 7.5e+003 9.9e-001 % RSD 1.7 2.0 1.8e+000 3.1 e+000 5.9e-001 Reported by User: Systẻm Project Name: Xuan Dieu Report Method: XD QAB do lap lai Date Printed: Report Method I 5699 9/18/2015 Page: 2 of 7 8:49:13 AM Asia/HoChiMinh